Základní principy analytických metod

Příklad využití gelové chromatografie v klinické biochemii – stanovení makroamylázy.

Gelová permeační chromatografie (GPC) bývá řazena k rozdělovací chromatografii, která bude podrobněji popsána v jiné části.  K dělení dochází na pórovitém gelu (molekulovém sítu) a rozhodující je velikost dělených molekul. Gel je pevnou fází, pohyblivou kapalnou fází je eluční roztok. Pro tuto metodu se někdy užívá názvu „obrácená filtrace“. Důvod je ten, že z kolony plněné gelem odcházejí, na rozdíl od filtrace, jako první velké molekuly a teprve potom postupně molekuly menší. Podrobněji bude gelová chromatografie popsána v kapitole věnované ostatním chromatografickým  metodám.

Amyláza se vyskytuje v organismu podle původu ve dvou izoenzymech slinném a pankreatickém. Oba tyto izoenzymy mají molekulovou hmotnost přibližně 57 000 Da. Vzhledem k poměrně malé molekule je schopná se filtrovat v glomerulech a přecházet do moče kde její aktivitu také měříme. V některých případech dochází k zvětšení enzymatické aktivity amylázy v plasmě v porovnání s její aktivitou v moči, což je možné ověřit  vypočtením frakční exkrece amylázy (FE _amyl). Při  hodnotách FE _Amyl menších než 0,01 je možné uvažovat na přítomnost makroamylázy v plazmě. Makro forma má hodnotu molekulové hmotnosti vyšší (obvykle nad 150 000 Da). Vhodnou metodou na její průkaz je využití gelové chromatografie na Sephadexu G-100. V jednotlivých frakcích můžeme proměřit aktivitu amylázy a například koncentraci albuminu, který má molekulovou hmotnost 67 000 Da. Makroamylázu vzhledem v velké molekule naměříme v prvních frakcích, normální amyláza se pak bude vyskytovat následujících frakcích přibližně společně s albuminem.  

Obr.  36 Malé částice amylázy vnikají dovnitř vhodně zvoleného gelu (Sephadex S 100) a tím jsou zpomalovány. Makroamyláza, která gel obtéká, opouští kolonu dříve.