Základní principy analytických metod

1. Autoři a úvod

Autor: Ing. Ladislav Trefil

Recenzenti: Ing. Miroslav Zábranský, Ing. Václav Senft, MUDr. Daniel Rajdl, Ph.D.

Úvod

V biochemické laboratoři se používají různé analytické metody k stanovení koncentrací důležitých látek v tělních tekutinách a tkáních nebo se měří různé vlastností vzorků. V historii se nejdříve popisovaly některé jednoduché fyzikální vlastnosti, jako je na příklad barva moče, přítomnost zákalu, cukru apod. Postupem času se tato, většinou kvalitativní stanovení, rozšiřovala o kvantitativní testy na stanovení koncentrace jednoduchých látek obsažených v moči a v krvi. Od druhé poloviny 19. století až dodnes se neustále rozšiřuje počet stanovovaných látek a s tím souvisí neustálé zdokonalování analytických metod. V dnešní době se rozšířilo používání automatických uzavřených systémů, kde uživatel nemůže do průběhu analýz zasahovat a často nezná ani přesný pracovní postup. U jednoho analytického systému se principy analytických metod často kombinují, aby se dosáhlo co nejlepších parametrů stanovení. V dnešní době je analytika v klinických laboratořích na tak vysoké úrovni, že často dokáže stanovit více analytů, než je možné lékařsky interpretovat. S jistou nadsázkou se říká, že lékařská věda dosáhla takového pokroku, že nikdo na světě není zdravý. To platí i o látkách stanovovaných v biochemických laboratoří. 

Následující text by měl sloužit k seznámení se základními principy laboratorních metod a tím pomoci pracovníkům laboratoře pochopit činnost moderních přístrojů. Znalostí základních metod se snáze vysvětlují některé nestandardní výsledky a odstraňují jednoduché poruchy přístrojů. S řadou jevů se setkáváme i v běžném životě a jejich pochopením si můžeme zvýšit úroveň našeho všeobecného vzdělání. 

Celý text je rozdělen na dvě části. První obsahuje principy metod, které se používají ve většině biochemických laboratořích, druhá část seznamuje s metodami, které jsou složitější a můžeme se s nimi setkat na větších nebo specializovaných  pracovištích. K pochopení všech metod jsou nutné základní chemické, fyzikální a matematické znalosti na úrovni středních škol, které si budeme ve výkladu opakovat.

2. Optické analytické metody

Optické analytické metody mají v současné laboratorní analýze nezastupitelné místo. 

K měření využívají nějaký zdroj záření. Do této skupiny patří metody využívající nejen viditelnou oblast záření, ale také ultrafialovou (UV) a infračervenou (IR) část elektromagnetického záření.  Viditelná oblast záření je ohraničena vlnovou délkou 380 - 780 nm. Sluneční světlo obsahuje plné elektromagnetické spektrum, mluvíme o polychromatickém záření. Atmosféra (ozonová vrstva) slouží jako polopropustné zrcadlo, které zadržuje nebezpečné sluneční a kosmické elektromagnetické záření. Do optických metod zahrnujeme i metody prováděné pomocí ultrafialového záření (UV světlo). které má vlnovou délku nižší než viditelné světlo a méně časté je i použití infračerveného záření (IR) s vlnovou délkou vyšší než viditelné světlo. Otázkou, co je to vlastně světlo, se zabývalo mnoho vědců, někteří tvrdili, že je to proud částic, jiní ,že se jedná o vlnění. Nyní mluvíme o jednotě vlny a částice (dualismus světla) - světlo má současně vlastnosti vlny i částic (fotonů) a záleží na způsobu zkoumání chování záření, která z těchto vlastností se projeví. Viditelné světlo je pouze velmi malá část spektra elektromagnetického záření. 

Frekvence (kmitočet)  ν (ný)  je počet kmitů vykonaných za jednu sekundu, jednotkou je hertz (Hz), který má rozměr s ^-1. Frekvence je základní vlastností elektromagnetického záření. Zůstává konstantní při přechodu záření z jednoho do druhého prostředí.

Rychlost světla ve vakuu   c = 2,9979. 10 ⁸  ms^-1 , tj. přibližně 3 10 ⁸  ms^-1. V jiných prostředích je rychlost světla nižší. 

Vlnová délka  λ (lambda) je vzdálenost mezi dvěma vrcholy vln. Má jednotku délky a ve viditelné a ultrafialové oblasti spektra je udávána v nanometrech (1 nm = 10^-9 m). V prostředí, ve kterém je rychlost světla nižší než ve vakuu, je nižší i jeho vlnová délka.

Energie fotonu je přímo úměrná jeho frekvenci  Záření s nižší vlnovou délkou má větší frekvenci a větší energii.     

Obr. 1  Elektromagnetické spektrum

Obr. 2  Spektrum viditelného světla

Světlo nese určitou energii a optické metody dělíme na metody, kde dochází.

•  k výměně energie mezi hmotou a zářením - metody nazýváme spektrální 
•  k výměně energie nedochází, ale dochází ke změně rychlosti světla, optické aktivity,     rozptylu na částicích - metody nespektrální 

Nyní si popíšeme některé spektrální metody, kde dochází k výměně energie. Světlo může být odraženo, propuštěno nebo pohlceno. Různá barviva pohlcují světlo různých vlnových délek. Všechny vlnové délky pohlcuje černé barvivo, naopak bílá barva světlo odráží. Listový chlorofyl pohlcuje červené a modré světlo, zelené odráží, a my pozorujeme zelenou barvu listů. Barva látky, kterou pozorujeme, je doplňkovou barvou k barvě, která byla absorbována. Energie pohlceného fotonu je předána elektronu, který je vyzdvižen ze základního stavu do stavu vybuzeného. Tento stav je nestálý, a tak následuje opět pád do základního stavu a přebytečná energie se vyzáří jako teplo. Například bílé auto je na slunci chladnější než tmavé, protože odráží viditelné světlo, tmavé auto světlo pohlcuje a vyzařuje jako teplo, které cítíme. Když světlo narazí na povrch předmětu, část se odráží a část je pohlcena, povrch se velmi slabě zahřeje. Každý druh atomu absorbuje určité vlnové délky světla a barva povrchu záleží na tom, které vlnové délky vstřebává a které pohlcuje. Podobné je to i s roztoky. Bezbarvý roztok viditelné světlo neabsorbuje, naproti tomu černý roztok dokonale absorbuje. 

Tabulka 1: Barva absorbovaného světla, jeho vlnová délka a barva látky (doplňková barva) 

2.1. Spektrofotometrie

Absorpce světla se využívá v biochemických stanoveních nejdůležitějších látek obsažených v biologických tekutinách. Jen málo látek můžeme stanovit takzvanou přímou spektrofotometrií. Jako příklad takové látky je stanovení bilirubinu u novorozenců. Je tomu tak proto, že bilirubin absorbuje při určité vlnové délce a sérum novorozenců ještě neobsahuje žádné látky, které by absorbovaly při této vlnové délce a tím stanovení rušily. Jakmile je novorozenec přiživován, může sérum obsahovat absorbující látky a přímá spektrofotometrie není možná. Většinu látek stanovujeme po přídavku nějakého činidla, které reaguje s látkou, kterou chceme stanovit, a vytváří produkt, který specificky absorbuje v určité oblasti viditelného nebo ultrafialového spektra. Při vzniku barevného produktu můžeme z výše uvedené tabulky usuzovat na vlnovou délku, kterou lze při spektrofotometrických stanoveních využít. Prakticky vždy je naší snahou použít takovou vlnovou délku světla, které je co nejvíce absorbované. Při této vlnové délce je nejvyšší citlivost měření. Máme-li tedy měřit žluté produkty reakce, použijeme vlnovou délku cca 450 nm, modrý filtr. Bezbarvé roztoky mohou absorbovat neviditelné ultrafialové záření 340 nm.

Obr. 1  Absorbce světla v kyvetě, pojem transmitance (propustnost)

Zářivý tok  φ₀  je při dopadu na kyvetu s barevným roztokem ochuzen o odražené, rozptýlené a absorbované záření. Z kyvety nám tedy vystupuje zeslabený zářivý tok  φ ,  který můžeme měřit. Relativní část prošlého záření  vyjádřená v procentech se nazývá transmitance (propustnost) T.

Transmitance se mění inverzně, se stoupající koncentrací absorbujících produktů klesá, a to logaritmicky (obr.2)  Z tohoto důvodu byl zaveden záporný logaritmus transmitance, který se nazývá absorbance. Závislost absorbance na koncentraci je lineární (obr.3). Na tomto obrázku modrá přímka neprochází počátkem, to znamená, že slepá zkouška, která neobsahuje žádný měřený analyt, má při zvolené vlnové délce nějakou hodnotu absorbance. Měřením proti slepé zkoušce se přímka posune k nule, znázorněno šipkou.

A  = -  log T

Absorbance je bezrozměrné číslo, které může nabývat hodnot od nuly (T=100%), maximální propustnost, až k nekonečnu, při prakticky nulové propustnosti.

Pro nás je důležité, že absorbance je přímo úměrná koncentraci a tloušťce absorbující vrstvy. Tento vztah je vyjádřen Lambert-Beerovým (L.B.) zákonem, kde konstanta úměrnosti je  molární absorpční koeficient (ε ):

                        A =  ε . c . d   

ε  = molární absorpční koeficient, je konstanta charakteristická pro měřenou látku. Při  

      platnosti L.B. zákona je  nezávislá na koncentraci absorbující látky. 

     c  = látková koncentrace (mol/l)

d  = tloušťka absorbujícího prostředí (kyvety) (cm)

A  = absorbance (bezrozměrné číslo)

Obr. 2  Závislost transmitance na koncentraci

:

Obr. 3: Závislost absorbance na koncentraci             

Zákon L.B. je zákonem mezním, tj. platí:

• pro monochromatické světlo
• pro zředěné roztoky (koncentrace absorbující látky musí být menší než 0,01 mol)
• za předpokladu, že absorbující částice nepodléhají žádným změnám (interakcím)
• za předpokladu, že v měřeném roztoku je pouze jedna absorbující složka (aditivita absorbancí)

Odchylky od Lambert-Beerova zákona nastávají:

• V roztocích, kde změnou koncentrace analyzované složky se mění chemická rovnováha
• Ve značně koncentrovaných roztocích, kde dochází ke změně indexu lomu a tomu odpovídá odchylka od lineárního průběhu
• V roztocích  s koloidními částicemi (odraz a rozptyl), nespecifická absorpce s difuzním rozptylem, falešná absorpce záření, zvýšení intenzity sekundárním rozptylem ve směru paprsku
• Při fluorescenci částic přítomných ve vzorku, sekundárně emitované záření budí dojem, že propustnost je vyšší, absorbance se s rostoucím počtem částic snižuje, lze potlačit vhodným filtrem nebo  bichromatickým měřením
• Ve složité matrici vzorku, pozadí (lipémie, bilirubin, hemoglobin)
• Při nedostatečná monochromatičnosti světla (filtr 10-50 nm, hranol 1 –10 nm, mřížka 0,5-2 nm)
• Při špatně zvolenýchexperimentálních  podmínkách (nedostatečná, nízká konc.činidla, krátká reakční doba atd.)

Obr. 4: Závislost chyby měření na absorbanci

Chyby spojené s měřením absorbance.

Nejpřesnější měření absorbance je v rozmezí transmitance 15 – 65 %, což odpovídá absorbanci mezi  0,2 – 0,8. S většími a menšími hodnotami chyby narůstají. Závislost je znázorněna na 

obr. 4. Nutno podotknout, že kvalitní moderní přístroje dokáží měřit absorbanci do vyšších hodnot a udané rozmezí platí hlavně pro manuální práci, ale snažíme se upravit poměry vzorku a činidel tak, aby chyby byly ve stanoveném rozmezí, které je pro každou metodu jiné.

Absorpční spektrum

    Absorpční spektrum se nejčastěji graficky vyjadřuje jako závislost A na vlnové délce. Získá se měřením A při různých vlnových délkách manuálně, nebo pomocí registrujících automatických spektrofotometrů. Při zavádění metody je dobré znát  spektrum pro vzorek, kalibrační materiál a slepou zkoušku (neobsahuje měřený analyt). Nejlepší kalibrátory jsou ty, které mají podobné složení jako měřené vzorky, zde se dá předpokládat i podobné absorpční spektrum. Vlastní měření se nejčastěji provádí v maximu, kde je nejvyšší hodnota molárního absorpčního koeficientu, a tím největší citlivost a nejmenší chyby při nedostatečné monochromatičnosti světla. Na následujících obrázcích (5.,6.) je spektrum redukované (NADH) a oxidované formy (NAD⁺) nikotinamid adenin dinukleotidu. Všimněte si oblasti okolo vlnové délky 340 nm označené šipkou, kde absorbuje pouze redukovaná složka. Vzájemné přeměny oxidované a redukované složky se využívá jako identifikační reakce v celé řadě biochemických stanovení.

Obr.   5 Absorpční spektra NAD⁺  a  NADH , maximum absorbance při vlnové délce  340 nm

             se využívá v optických testech. 

Přístrojové vybavení

Přístroje na měření absorbance se nazývají fotometry. Jako spektrofotometr se obvykle označuje fotometr s lepší spektrální kvalitou záření (mřížka, hranol), často lze na něm zaznamenat automaticky absorpční křivku. Můžeme je dělit na:

• jednopaprskové přístroje, které měří postupně nejdříve neabsorbované záření (slepou zkoušku) a potom absorbanci vlastního vzorku
• dvoupaprskové  přístroje, které porovnávají po průchodu monochromátorem, (viz níže),  dva paprsky, jeden jde přes neabsorbující prostředí slepé zkoušky a druhý současně přes absorbující vzorek.

Základní části spektrofotometrů:

• zdroj zářivé energie
  • žárovka s wolframovým vláknem plněná inertním plynem (krypton, argon, dusík) dává pouze 15% zářivé energie, využívá se hlavně pro viditelnou oblast (VIS)
  • halogenová žárovka obsahuje stopy halogenu k wolframovému vláknu, záření je posunuto do blízké UV oblasti (od 320 nm),.Tento zdroj často využívají spektrofotometry a analyzátory používané v klinických laboratořích
  • výbojky dávají spojité i nespojité záření pro UV-VIS spektrum, jsou to trubičky naplněné plynem nebo parami, proud prochází jako obloukový (doutnavý) výboj a elektron způsobuje excitaci atomů. Nejčastěji využívané: deuteriová výbojka, 

rtuťová výbojka (spektrální Hg lampa), u které využíváme určité vlnové délky dané čarovým spektrem rtuťové výbojky.

• Laser (Light Amplifier by Stimulated Emission of Radiation) v překladu zesílení světla pomocí stimulované emise záření. Výhody tohoto druhu záření:
  • vysoká monochromatičnost světla a frekvenční stabilita
  • malá rozbíhavost 
  • koherentní záření, vlny jsou zfázované, extrémní soustředění záření do úzkého paralelního svazku, laserové paprsky je možné vysílat na značnou vzdálenost
  • příkladem může být helium-neonový plynový laser, vlnová délka  632,8 nm

• disperzní zařízení, monochromátory

Slouží k izolaci úzkého pásma vlnových délek z polychromatického zdroje záření. Čím je užší pásmo vlnové délky, tím je metoda selektivnější, správnější, citlivější a lépe reprodukovatelná při přechodu na jiný analyzátor, který musí mít podobně kvalitní disperzní zařízení. Vlnová délka měření se nejčastěji vybírá v maximu absorpčního spektra měřené látky, kde je metoda nejcitlivější a nejlépe reprodukovatelná. Existují výjimky, kdy se měří mimo maximum, když potřebujeme potlačit současné absorbance interferujících látek nebo posunout absorbanci cíleně k nižším hodnotám. Kvalitu disperzního zařízení hodnotíme podle pološířky, což je rozpětí vlnových délek v polovině maximální propustnosti zařízení. Čím je interval užší, tím je kvalitnější výběr vlnové délky

• filtry (10 - 50 nm)
• hranol 1 - 10 nm)
• reflexní mřížka (0,5 - 2 nm)

Obr.  6 Princip rozkladu světla optickým hranolem, obdobně se rozkládá světlo na 

             kapičkách deště při tvorbě duhy.

• absorpční prostředí
• detektory záření převádějí optický signál na měřitelný elektrický. Používají se jednoduché fotoelektrické články a polovodičové články, které pokrývají celý měřící interval vlnových délek. Na takových zařízeních nazývaných diode array detektory je možno měřit současně při různých vlnových délkách   

Obr.  7 Schema klasického spektrofotometru např. Spekol

Obr.  8 Dioda array detekce, rozklad světla mřížkou až po jeho zeslabení absorpcí vzorkem.Tímto způsobem měří automatické analyzátory, kdy je možné si vybrat současné měření při dvou vlnových délkách (Olympus má 13 diod  v rozsahu vl. délek 340 - 800 nm). Při měření AST (viz níže) používáme primární vlnovou délku 340 nm a sek. 660 nm. 

Postupy pro stanovení koncentrace látek (kalibrace)

Pro stanovení koncentrace základních látek v biologických tekutinách musíme příslušnou metodu kalibrovat. Kalibraci provádíme pomocí standardních roztoků. Nejjednodušší je využití dvou standardních roztoků, kdy jeden standardní vzorek neobsahuje měřenou látku, říkáme mu také slepá zkouška (blank), a druhý standardní vzorek má vhodnou koncentraci sledované látky. Tímto způsobem kalibrace předpokládáme, že  pro stanovení platí Lambert - Beerův zákon.Kalibrační materiál by se měl spektrofotometricky chovat podobně jako vzorek biologického materiálu. Z tohoto důvodu se někdy místo vodných roztoků používají kalibrátory mající obdobné složení jako vzorek se známým obsahem stanovovaných látek. Pomocí takto připravených kalibrátorů můžeme kalibrovat široké spektrum metod, což je výhodné u automatických analyzátorů. Metoda je postavena tak, aby lineární kalibrace vyhovovala pro co největší počet měřených vzorků. V praxi se setkáváme se vzorky, které mají extrémně nízké nebo vysoké hodnoty. Dolní mez stanovitelnosti je dána mezí detekce, která vypovídá o citlivosti metody. Pod mezí stanovitelnosti nevydáváme číselný výsledek,pouze “menší než (< číslo meze stanovitelnosti)”. Horní mez stanovitelnosti nám udává hodnotu, kam až je metoda lineární. 

Opakováním měření předepsaným ředěním se můžeme dostat do mezí, kdy je vzorek správně změřen a číselný výsledek dostaneme po vynásobení faktorem ředění. Na obrázku č. 9 je příklad metody, kde je červenou křivkou vyznačena absorbance v závislosti na stoupající koncentraci. Dolní a horní mezí stanovitelnosti je určený rozsah linearity. V případě vyšších koncentrací je doporučeno ředění vzorku a opakování měření. Výsledek dostaneme vynásobením faktorem ředění. U ještě vyšších extrémních hodnot může být doporučeno větší ředění, nebo se vydává “větší než”. Automatické analyzátory dokáží provést ředění vzorku snížením dávkovaného objemu vzorku a naopak u nízkých hodnot zvětšením objemu vzorku. Výsledky se přepočítávají podle manipulace se vzorkem. Pro nás je důležité si uvědomit, že nejsprávnějších výsledků je dosahováno ve stanovených limitech a každá úprava vzorku přináší větší analytickou chybu a samozřejmě i zdržení způsobené opakováním analýzy. Zacvičený laborant by měl umět vysvětlit důvod, proč je vzorek opakován a extrémní hodnoty hlásit s tím, že výsledek bude upřesněn po opakování například ředěného vzorku. Včasné nahlášení možného extrému je často pro lékaře cennější než čekání na výsledek po opakování. 

Obr.  9 Příklad metody s dolní a horní mezí stanovitelnosti 5 - 60 mmol/l (zelené šipky),  u vzorků s koncentrací vyšší než 60 mmol/l je doporučeno ředění 1:1, opakování měření a výsledek násobit faktorem ředění (F=2) . Při hodnotách nad 120 mmol/l  (červená šipka) nám ani toto ředění nestačí, větší ředění nepoužíváme a výsledek vydáváme > 120 mmol/l .

Obr.  10 Kinetické stanovení s rozdílným složením substrátu. Červená přímka s nižší směrnicí, 

              metoda je méně citlivá. V grafu jsou uvedeny rovnice přímek a hodnoty pro rozdíl 

              0,01 A/min u obou kalibrací.

Musíme se také zmínit o kvalitě vzorku. Kalibrace metody často platí pouze pro vzorek, který není hemolytický, ikterický nebo chylózní. V případě těchto vzorků může docházet například k absorbanci pozadí a dalším ovlivněním, výsledek pak bude zkreslen. Proto má každá metoda stanovena kritéria, kdy lze výsledek vydat, případně je k výsledku připojena varující poznámka. Ordinující lékař nebo sestra by měli být přístupni požadavku laboratoře k zaslání nového vzorku, zvlášť když je povaha vzorku ovlivněna preanalytickou chybou. Všechny rutinní metody jsou v laboratoři kontrolovány na nejméně dvou hladinách v rozmezí normálních, snížených nebo zvýšených hodnot. Když jsou hodnoty kontrol mimo stanovenou mez, provádí se upravení nebo rekalibrace metody opět s následnou kontrolou. 

Některé analyticky složitější metody nejsou lineární a nebo jsou lineární pouze v určitém rozsahu. Takové metody se kalibrují na více standard (až 6) v celém rozmezí. Kalibrační křivka je vyjádřena nějakou složitější matematickou funkcí, kterou jsou schopné moderní analyzátory vypočítat a v celém rozsahu vydávat výsledky.

Průběh reakce

Reakce stanovované látky s činidly probíhá různou rychlostí. Metody jsou velmi často prováděné jako dvoučinidlové. První činidlo označované jako R1 připravuje většinou podmínky pro následnou reakci. Jeho objem bývá větší než činidla R2 a směs vzorek + R1 se určitý  konstantní čas inkubuje. U rutinních analyzátorů (např. Olympus AU) je tato inkubace dlouhá 5 minut. Po této době se přidáním R2 startuje reakce stanovované látky s činidlem (substrátem). V první lag fázi se reakce rozbíhá, potom nastává nárůst absorbance, který se u metod do konečného bodu obvykle zpomaluje. U analyzátorů je tato doba opět 5 minut. Celé stanovení probíhá při konstantní teplotě 37^o C. Automatické analyzátory sledují absorbanci celého průběhu stanovení. Řada analyzátorů Olympus AU má celkem 27 fotometrických měření během uvedené doby 10 minut. Podle průběhu reakce a stanovované látky si můžeme vybrat z celé řady kombinací odečtu absorbancí. 

• jednobodový test do konečného bodu (end point) - měříme jeden bod po prakticky skončené reakci

Obr.  11 Příklad metody end point, stanovení bílkoviny (hodnota75 g/l), AU 2700,  

   dvoučinidlová metoda (R1,R2), měření primární a sekundární vlnové délky, 

   pro výpočet rozdíl absorbancí těchto vlnových délek v 27 fotometrickém bodě 

   (zelená oboustranná šipka), faktor je poměr koncentrace standardu a rozdílu 

   jeho absorbancí

• dvojbodový test - výpočet provádíme z rozdílu absorbancí před přidáním druhého činidla a po proběhlé reakci. Při tomto způsobu je eliminována možná absorbance vlastního vzorku způsobena jeho hemolýzou, chylozitou nebo ikteritou. Další možností je dvoubodové měření po přidání druhého činidla při nelineárním průběhu reakce, příkladem může být Jaffého reakce při stanovení kreatininu viz obr.

Obr. 12  Příklad dvoubodové metody stanovení kreatininu Jaffého reakcí (hodnota 855 μmol/l) , AU 2700, dvoučinidlová metoda (R1,R2), měření primární a sekundární vlnové délky, pro výpočet se využívá měření ve 24. a 13. fotometrickém bodě, měří se při dvou vlnových délkách. K výpočtu se používá rozdílu absorbancí mezi 24. a 13. fotometrickým bodem (je označen černou šipkou), faktor je poměr koncentrace standardu s rozdílem absorbancí měřených stejným způsobem. Nelineární charakter reakce neumožňuje použít měření reakční rychlosti mezi těmito fotometrickými body. 

• měření rychlosti reakce se používá u kinetických metod, nejčastěji při stanovení katalytické aktivity enzymů ,viz dále. Rychlost se počítá z více fotometrických měření a vyhodnocuje se i linearita průběhu reakce. 

Stanovení enzymové aktivity.

Enzym má velkou substrátovou specifičnost a značnou katalytickou účinnost. Pro správnost měření:

a)   musíme mít substrát, který je rozkládán pouze stanovovaným enzymem 

b)    v reakční kyvetě musí být vhodná koncentrace substrátu, aby nedocházelo v měřeném intervalu k ovlivnění rychlosti reakce jeho koncentrací

c)   ke stanovení substrátu (jeho úbytku) nebo produktů enzymatické reakce musíme mít vhodnou metodu (využití měření při 340 nm pro změny v koncentraci NADH) 

Reakce musí probíhat konstantní rychlostí tzn. úbytek substrátu nebo přírůstek produktu v čase musí být lineární, nezávislý na koncentraci reagujících látek.

Enzymovou aktivitu (katalytickou koncentraci vyjadřujeme v katalech).

1 katal odpovídá takové katalytické koncentraci enzymu, která katalyzuje za optimálních podmínek přeměnu 1 molu substrátu za 1 sekundu. Pro biochemické vyjádření aktivity je tato jednotka příliš velká, a proto se používá μkatal nebo nkatal. V zahraniční literatuře se stále můžeme setkat s mezinárodní jednotkou U. Definice je obdobná jako u jednotky katal, ale jde o přeměnu 1 μmolu za jednu minutu.  1μkatal = 60 U ; 1 U = 16,66 nkatal

Obr. 13   Příklad kinetického stanovení AST (hodnota 5,45 μkat/l), AU 2700, dvoučinidlová metoda (R1,R2), měření primární 340 nm a sekundární vlnové délky 660 nm (absorbance sekundární vlnové délky je pro náš případ tak nízká, že absorbance primární vlnové délky se prakticky nemění, resp. se nepatrně sníží stejně pro všechny měřené fotometrické body), pro výpočet rychlosti úbytku substrátu se využívá měření ve 13. a 20. fotometrickém bodě, v tomto rozmezí se sleduje linearita reakce a z rozdílu absorbancí, které jsou označeny černou šipkou, je možné vypočítat úbytek absorbance za 1 minutu (pro toto stanovení je 0,1267).

Faktor se stanoví při kalibraci použitím kalibrátoru s deklarovanou hodnotou aktivity AST, která je dělená změnou absorbance za 1 minutu. 

Pro AST se sleduje úbytek NADH ⇒ NAH⁺ (porovnej s grafy spekter obr.5, 6)

2.2. Turbidimetrie a nefelometrie

Při turbidimetrii se měří úbytek intenzity dopadajícího záření, který je způsoben rozptylem záření na koloidních částicích roztoku a absorpcí záření v těchto roztocích. Mezi turbidimetrií a  spektrofotometrií není podstatný metodický rozdíl, měření se běžně provádějí na rutinních fotometrech.

V nefelometrii se měří intenzita záření, které vzniká rozptylem na částečkách mikrosuspenze a které vychází z roztoku směrem odlišným od směru dopadajícího záření. Postup měření je tedy podobný  fluorimetrii, pro nefelometrické měření je však (na rozdíl od fluorimetrického) vlnová délka vstupujícího záření a vlnová délka měřeného záření shodná. 

Obr.  14 Schema turbidimetrie a nefelometrie. Šipkou je naznačeno, že úhel měření  

              rozptýleného světla při nefelometrii nemusí být 90^੦ . 

2.3. Luminiscenční metody

Některé látky dovedou přeměnit část pohlcené energie na záření. Této vlastnosti látek se využívá u moderních analytických metod.Tyto metody dělíme podle toho, jakým způsobem  je dodávaná energie na:

• Fotoluminiscenční - k excitaci dochází absorpcí elektromagnetického záření
• Chemiluminiscenční - excitace je způsobena energií chemických reakcí
• Elektroluminiscenční -  energie dodána v podobě elektrického pole nebo

         elektrického proudu

Fluorescenční metody

V klinické biochemii se často používají fluorescenční metody, které patří do  fotoluminiscenčních metod a jsou z hlediska detekce citlivější než absorpční metody. V průměru jsou fluorescenční metody o dva až čtyři řády citlivější než absorpční spektrofotometrie. 

Podle střední doby života excitovaného stavu dělíme fotoluminiscenci na:

• metody s krátkým dosvitem 10^-8 s až 10^-5 s -   fluorescenci
• metody s dlouhým dosvitem 10^-2 s a více -  fosforescenci 

Nejčastěji se měří fluorescence ve viditelné a UV oblasti. Energie emitovaného záření je vždy menší než energie excitačního záření, část energie se ztrácí ve formě tepla, přechodem na nejnižší vibrační hodnotu excitovaného stavu. Rozdíl mezi energií excitace a emise se projevuje posunem vlnové délky mezi excitačním a emisním zářením k vyšším vlnovým délkám u emise. Při fluorescenci je vlnová délka vyšší průměrně o 30 – 50 nm, při fosforescenci je tento posun vyšší (až 200 nm). Emitované záření má podobné charakteristické spektrum jako absorpční spektrum posunuté k nižším energiím, to znamená k větším vlnovým délkám (viz obr.1, tab.1).

Při hledání optima podmínek měření fluorescence můžeme na některých přístrojích proměřit celá spektra. Excitační (aktivační) spektrum je závislost fluorescence (emise) na vlnové délce excitačního záření, která se průběžně mění. Z tohoto spektra určujeme většinou takovou vlnovou délku, při které je maximální emise. Emisní (fluorescenční) spektrum se proměřuje při konstantním excitačním záření, a určuje optimální (maximální) vlnovou délku emise.  

Obr.  15 Fluorimetrické měření 

Kvantový výtěžek fluorescence (QF ) - charakterizuje fluoreskující látku a je mírou intenzity emise. 

QF = energie emitovaná / absorbovaná = N_em/ N_ext

0 – látka nefluoreskuje, hodnota se blíží 1 - látka intenzivně fluoreskuje

Intenzita fluorescenčního toku  je přímo úměrná :

• Intenzitě zářivé energie budícího zdroje
• Molárnímu absorpčního koeficientu fluoreskující látky
• Kvantovému výtěžku fluorescence
• Koncentraci fluoreskující látky

Závislost  je lineární pouze pro velmi nízké koncentrace, při vyšších dochází k zakřivení směrem k ose koncentrace, to znamená, že pro dvě různé koncentrace můžeme naměřit stejné hodnoty fluorescence. Pro daný systém a přístroj je nutné stanovit experimentálně závislost fluorescence na koncentraci a vymezit lineární rozsah. Jev, kdy dochází k zeslabení fluorescence, nazýváme zhášení fluorescence a může být způsobeno:

• koncentračním zhášením, větší počet srážek mezi excitovanými molekulami a molekulami v základním stavu, čím se uvolní energie v nezářivé formě.
• vnitřním filtračním efektem
• zeslabením budícího záření absorpcí roztoku
• absorpcí sekundárního emitovaného záření jinými sloučeninami roztoku
• u koncentrovaného roztoku nejsou excitovány molekuly fluoroforu v celé hloubce
• důležitá je čistota rozpouštědel (voda v polyethylenových nádobách). Chemikálie mohou fluorescenci nejen zhášet, ale i vyvolat, vždy je nutné proměřit slepou zkoušku.
• nejčastějším zhášedlem fluorescence je molekulární kyslík

Citlivost fluorimetrických stanovení vzrůstá s rostoucí intenzitou excitačního, primárního záření. Velikost signálu je ve fluorimetrii v lineární oblasti přímo úměrná koncentraci a vyjadřuje se v jednotkách RFU (relativní fluorescenční jednotky). Principu fluorimetrie se využívá u fluorimetrických detektorů v HPLC, fluorescenční značka je často využívaná u imunochemických metod, fluorescenční mikroskopie nebo u  průtokové cytometrie.

Obr. 16  Měření fluorescence mikrotitračních destiček.Fluorimetr se opatří nástavcem na mikrotitrační destičku. Na obrázku je znázorněn pouze jeden strip destičky a naznačen pohyb destičky pod zdroj excitačního záření, které propouští excitační filtr (modrá šipka), fluorochrom v mikrotitrační destičce emituje záření (zelená šipka), které propouští emisní filtr na detektor. Červená přerušovaná šipka znázorňuje odfiltrované emisní záření (může být z jiného pro nás neměřeného fluorochromu). Když si představíme místo mikrotitrační destičky fluorogenní mikroskopický preparát, místo optického zařízení objektiv a  místo detektoru emisního záření okulár, máme před sebou jednu s možných konstrukcí fluorescenčního mikroskopu. 

3. Elektrochemické metody

Elektrochemické (elektroanalytické) metody se zabývají vlastnostmi a reakcemi elektrolytu při průchodu elektrického proudu nebo za rovnovážných podmínek. Vycházejí z poznatků odvětví fyzikální chemie, které se nazývá elektrochemie. Objektem zkoumání je elektrochemický článek, soustava, kde analyzovaný roztok je v kontaktu s elektrodami. Elektrody zprostředkují jeho spojení s měřícím přístrojem, který sleduje některou z elektrických veličin. 

3.1. Potenciometrie

Na odděleních klinické biochemie se metody založené na potenciometrickém principu měření využívají velice často. Stačí připomenout metody na všech analyzátorech acidobazické rovnováhy a měření pomocí iontově selektivních elektrod (ISE) na velkých rutinních analyzátorech. Potenciometrie je elektrochemická metoda založená na měření rovnovážného napětí článků. Článek se skládá ze dvou elektrod, měrné a referentní. Elektroda je heterogenní elektrochemický systém tvořený alespoň dvěma fázemi. Pevná fáze vede elektrický proud prostřednictvím elektronů, kapalná fáze elektrolyt  vede elektrický proud ionty. Elektrodový děj je oxidačně-redukční reakce umožňující přenos náboje mezi fázemi elektrody. Na základě dohody zapisujeme elektrodový děj chemickou rovnicí ve směru redukce: 

oxidovaná forma + n elektronů  ⇆ redukovaná forma 

Elektrody můžeme dělit podle jejich složení nebo podle použití.

    Podle složení:

• Kovové elektrody ponořené do roztoku, který obsahuje kation stejného kovu. Například stříbrná elektroda ponořená do roztoku obsahující Ag+, obdobně zinková elektroda v roztoku Zn2+ a pod. Do této skupiny patří i vodíková elektroda. Je to kationtová plynová elektroda složená z platinové elektrody pokryté platinovou černí sycené plynným vodíkem. V případě, že je tlak vodíku roven normálnímu tlaku 101 325 Pa a aktivita vodíkového kationtu je rovna jedné, mluvíme o standardní vodíkové elektrodě (SHE). Potenciál této elektrody byl konvenčně určen nulový a elektrodový potenciál libovolné elektrody je definován jako rovnovážné napětí článku tvořeného měrnou elektrodou jako katodou a standardní vodíkovou elektrodou jako anodou.
• Jiný druh elektrod tvoří kov pokrytý vrstvičkou své málo rozpustné soli ponořený v roztoku aniontů této soli. Do této skupiny patří důležitá argentochloridová elektroda (stříbrná el. pokrytá AgCl ponořená do KCl) a kalomelová (rtuť, kalomel Hg₂Cl₂ v KCl.
• Redoxní elektrody jsou tvořeny plíškem ušlechtilého kovu (platina,zlato) ponořeného do roztoku obsahujícího oxidovanou a redukovanou formu systému (Např. Fe²⁺/Fe³⁺)
• Membránové elektrody jsou iontově selektivní elektrody (ISE) využívající vzniku membránového potenciálu na membráně , která je nestejně propustná pro různé ionty.

Podle použití:

• Elektroda měrná (indikační, pracovní) je elektroda jejíž potenciál je závislý na koncentraci měřené látky v analyzovaném vzorku. Nejčastěji je to kovová, redoxní nebo membránová  elektroda.
• Elektroda referenční - její potenciál nezávisí na složení analyzovaného vzorku, 

                       nemění se ani procházejícím proudem, argentochloridová,kalomelová 

Příklady některých elektrod:

Skleněná elektroda

Skleněná elektroda  je nejznámější a nejdéle používanou membránovou elektrodou, která se používá jako měrná elektroda na měření pH. Skleněnou  elektrodu tvoří banička ze speciálního elektrodového skla. Na obou površích vně i uvnitř se vytváří vrstvička hydratované kyseliny křemičité, banička je naplněna pufrem o stálém pH a koncentraci chloridových iontů, do kterého je ponořena argentochloridová elektroda. Mezi pufrem uvnitř, vzorkem vně a hydratovaným povrchem skleněné baničky dochází k výměnné reakci za vzniku membránového potenciálu, který je uvnitř konstantní a vně závisí na koncentraci vodíkových iontů v měřeném vzorku (pH).   Vrstvička křemičitého hydrogelu na povrchu je polopropustná pro H⁺ ionty a chová se jako iontoměnič (výměna H⁺ z roztoku za Na⁺ ze skla). Skleněná elektroda musí být ponořena ve vodném roztoku, membrána musí být hydratována.  Potenciál skleněné elektrody se liší podle konstrukce a mění se stářím elektrody. Chyby v měření pH nastávají u extrémně vysokých a nízkých hodnot pH. Pro rozmezí pH 2 -12 je naměřený potenciál v lineárním vztahu k hodnotě pH. Provádí se dvoubodová kalibrace. Teoreticky přírůstek pH o jednu jednotku znamená pokles potenciálu o 0,059 V. 

Obr. 17 Závislost potenciálu skleněné elektrody na pH měřeného roztoku. Zelenou šipkou je 

       označena linéární závislost vhodná k měření. Při nízkém a vysokém pH roztoku vykazuje  

       elektroda chyby. Rozsah linearity závisí na konstrukci elektrody.

Skleněná elektroda se pro měření pH  používá v kombinaci s referenční nejčastěji argentochloridovou nebo kalomelovou elektrodou. Často bývá referenční elektroda zabudovaná v jednom tělese spolu se skleněnou elektrodou.  Skleněná elektroda je ve všech analyzátorech acidobazické rovnováhy. Speciální skleněnou elektrodu lze také použít jako sodíkovou iontově selektivní elektrodu (viz dále)

Obr. 18 Nahoře kombinovaná skleněná elektroda s argentochloridovou referenční elektrodou, dole 

       schema pH elektrody acidobazického analyzátoru

Severinghansova elektroda

Používá v acidobazických analyzátorech na přímé měření CO₂. Jedná se o skleněnou elektrodu, která je od vnějšího prostředí oddělena membránou propouštějící CO₂. V prostoru mezi membránou a skleněnou elektrodou dochází k následující reakci:

CO₂    +   H₂O        ↔    H⁺        + HCO₃^-

Aktivita protonu H⁺ v tomto prostoru je přímo úměrná parciálnímu tlaku CO₂ ve zkoumaném vzorku a je měřena vlastní skleněnou elektrodou. 

Obr.19   Severinghansova elektroda, mebrána propuští oxid uhličitý, který mění koncentraci   

        H⁺  v roztoku. Aktivita protonu H⁺ v tomto prostoru je přímo úměrná parciálnímu tlaku CO₂

        ve zkoumaném vzorku a je měřena vlastní skleněnou elektrodou. 

Obr. 20  Měření pH krve acidobazickým analyzátorem skleněnou elektrodou s referenční 

       argentochloridovou elektrodou. Stejná referenční elektroda slouží i na měření pCO₂ 

       Severinghansovou  elektrodou a ostatních iontů ISE (Na, K, Cl, Ca) 

Iontově – selektivní elektrody (ISE)

Jsou určeny k měření aktivit různých iontů a využívají vzniku membránového potenciálu na různých membránách. Podstata je obdobná jako u měření pH membránovou skleněnou elektrodou. Potenciál na vnější straně membrány závisí na koncentraci příslušného měřeného iontu, potenciál vnitřní membrány je konstantní. V elektrolytu je vnitřní  referenční elektroda. Iontově selektivní membrány jsou odděleny od biologických vzorků pro měříní iontů propustnou membránou zadržující proteiny. Přímou potenciometrií se v acidobazických analyzátorech měří Na⁺, K⁺ Cl ^-,ionizovaný vápník. Obdobně jsou konstruovány ISE u automatických analyzátorů, kde se před měřením provádí ředění vzorku.

3.2. Amperometrie

Tato technika se využívá na acidobazických analyzátorech k měření parciálního tlaku kyslíku pO₂ Clarkovou elektrodou, podobně se měří  enzymovými elektrodami glukoza a laktát. Na rozdíl od potenciometrie je na elektrody vloženo určité konstantní napětí a sledují se změny proudu při oxidaci nebo redukci látek na elektrodách. Na anodě probíhá oxidace, na katodě redukce. Platinová elektroda je polarizována negativním potenciálem 630 mV vůči argentochloridové elektrodě. Při tomto napětí se kyslík na katodě redukuje a stříbro na anodě oxiduje. Prostor elektrod je oddělen od přímého styku se vzorkem polypropylénovou membránou, která propouští kyslík do vnitřního elektrolytu,  v kterém jsou obě elektrody ponořeny.

Obr. 21  Schema Clarkovy elektrody na měření kyslíku. Na polarizované katodě dochází k redukci kyslíku při vloženém napětí 630 mV, na anodě oxiduje stříbrná elektroda na AgCl. Jako 

elektrolyt se používá fosfátový pufr 

Enzymové elektrody

Enzymové elektrody jsou biosenzory, kde pomocí enzymatické reakce vznikají nebo jsou spotřebovány látky  vhodné pro měření, které může být například optické, potenciometrické, ampérometrické, konduktometrické a jiné. Jako příklad uvedeme ampérometrické stanovení glukozy a laktátu. Enzymové elektrody na měření glukozy jsou v principu stejné na  acidobazických analyzátorech i v glukometrech. Na membráně je imobilizován enzym glukozaoxidáza (GOD), který katalyzuje oxidaci glukozy na kyselinu glukonovou a peroxid vodíku:

D - glukoza    + O₂     + H₂O   ⇒ D - glukonová kyselina    + H₂O₂

Peroxid vodíku difunduje polopropustnou membránou do elektrolytu, kde je polarizovaná platinová anoda a referenční Ag/AgCl katoda. Na anodě je vloženo napětí 675 mV, při kterém dochází k oxidaci peroxidu vodíku:

H₂O₂   ⇒ 2 H⁺   + O₂    + 2e^-

Vznikající proud, který je úměrný koncentraci glukozy, se sleduje na ampérmetru v závislosti na čase a odečítá se v bodě nejvyššího nárůstu. 

Laktátová enzymová elektroda pracuje na stejné ampérometrické iindikaci peroxidu vodíku, který vzniká z laktátu oxidací imobilizovaným enzymem laktát oxidázou:

Laktát  +    O₂     + H₂O   ⇒ pyruvát    + H₂O₂

4. Elektroforetické metody

Elektroforetické metody můžeme zařadit mezi elektromigrační separační metody, které využívají k separaci rozdílné pohyblivosti částic v elektrickém poli. Nejznámější z těchto metod je elektroforéza a izoelektrická fokusace. Obě tyto metody můžeme provádět i v kapilárním uspořádání. Méně často se v klinických laboratořích používá izotachoforéza.

4.1. Zónová elektroforéza

Elektroforéza  se používá  k rozdělení bílkovin krevního séra, močí, v kombinaci s imunochemickými metodami k průkazu paraproteinů, pomocí elektroforézy se rozdělují i fragmenty DNA po polymerázové řetězové reakci a také se užívá v proteomických analýzách.

Při volné elektroforéze docházelo k difúzi dělených iontů, a proto se nyní používá převážně elektroforéza na nosiči, která se nazývá zónová elektroforéza. Katodový, anodový prostor a elektroforetická komora jsou naplněny základním elektrolytem a dělené složky jsou během separace fixovány na nosiči napuštěném elektrolytem. Základní zařízení pro elektroforézu jsou elektroforetická komora a zdroj stejnosměrného proudu.

Jaké vlastnosti by měl mít nosič:

• neměl by klást odpor při migraci částic
• měl by být chemicky inertní vůči separovaným složkám, rozpouštědlu a detekčnímu činidlu

Při některých elektroforetických metodách využíváme nosiče, které se aktivně podílejí na dělení. Například agarozové gely jsou využívány v imunoelektroforetických metodách, polyakrylamidové gely se dají připravit s různým síťováním a dělení probíhá jednak podle velikosti náboje a také podle velikosti molekul. Který efekt se uplatňuje více závisí na vlastnostech dělených molekul a na gelu.

     Výsledný pohyb částic při dělení je daný součtem elektroforetické a elektroosmotické pohyblivosti. Elektroosmotická  pohyblivost (elektroendoosmóza) závisí na druhu nosiče, na potenciálním spádu, iontové síle a pH použitého pufru. Při dělení směrem ke kladnému pólu, anodě, působí proti směru elektroforetické síly. Jedná se o tok částic s kladným nábojem směrem ke katodě. Je-li elektroosmotický tok vyšší než elektroforetická síla působící na danou částici, je částice unášena tímto tokem směrem ke katodě. Elektroosmotickým tokem jsou unášeny nejvíce velké částice s relativně malým negativním nábojem (imunoglobuliny). Tento jev je možný u některých typů analýz využívat. Silnější je u nosičů, které mají hodné polárních skupin (agar).   

Obr.  22 Působení elektroforetické a elektroosmotické síly na dělené látky. U nosiče, který má hodně polárních skupin např. agaru jsou anionty fixovány na nosiči a kationty (nejen vodíkové ionty) jsou při vložení elektrického napětí pohyblivé, vzhledem k náboji se pohybují ke katodě a působí proti elektroforetické síle. Při malém relativním náboji převáží elektroendoosmoza nad elektroforetickou silou a záporně nabitá látka se pohybuje ke katodě. Katoda i anoda jsou ponořeny do stejného elektrolytu, který je pomocí můstků vodivě spojen  s nosičem. Tohoto zpětného pohybu u imunoglobulinů je možné využívat v některých imunoforetických metodách. 

4.2. Elektroforéza bílkovin séra

Elektroforéza bílkovin séra patří mezi základní biochemické stanovení, které se provádí v mnoha biochemických laboratořích. Také na toto stanovení se využívají moderní poloautomatické a automatické analyzátory. Pryč je doba, kdy bylo v elektroforetických laboratořích mnoho práce a o výsledku rozhodovala zručnost laboranta. V začátcích se připravovaly v laboratoři elektroforetické desky a pufry, běžné bylo ruční nanášení vzorků a barvení hotových elektroforéz.  Dnes jsou dodávány kity obsahující destičku, pufry a barviva, která se používají pro elektroforetické analyzátory téhož výrobce. Důsledkem je vysoká rozdělovací schopnost destiček, reprodukovatelnost a možnost správného vyhodnocování frakcí. Analyzátory mají programy i na elektroforetické dělení, barvení a vyhodnocení paraproteinů. Nejčastěji využívaný nosič je nyní agaroza, dříve se často využívala acetylovaná celuloza. 

Obr. 23  Příklad elektroforézy sérových bílkovin na agaroze. Současně dělí ve dvou liniích 30 vzorků, vyhodnocení č.2 - bez patologického nálezu a č.18- monoklonální gradient (M-komponenta,  “paraprotein”)

4.3. Elektroforéza bílkovin moče

Elektroforéza moče provádí na agaroze v neutrálním  prostředí s přídavkem dodecylsíranu sodného (SDS). Tento detergent  způsobuje, že mají všechny bílkoviny prakticky stejný náboj a dělení probíhá podle jejich relativní molekulové hmotnosti. Největší pohyblivost mají malé molekuly (mikroglobulin), albumin je cca uprostřed, nejmenší pohyblivost má makroglobulin. Výhodou této metody je, že se moč nemusí před analýzou zahušťovat, dělicí schopnost a ostrost je vysoká a elektroendoosmóza  nízká. Příklady dělení moče na agaroze s přídavkem SDS jsou uvedeny na následujícím obrázku. Barvení je provedeno krystalovou genciánovou violetí.

Obr. 24  Příklad elektroforézy moče na agaroze v přítomnosti SDS, bílkoviny se dělí pouze podle velikosti molekul: 1- smišená proteinurie, 2- glomerulárni selektivni proteinurie, 3- glomerulárni neselektivni proteinurie, 4- tubulárni proteinurie, 5- albuminurie

4.4. Izoelektrická fokusace (IEF)

Izoelektrická fokusace slouží k separaci amfolytů (aminokyselin, peptidů, proteinů), kdy pH prostředí, ve kterém se tato látka nachází, rozhoduje o jejich náboji. Každý amfolyt má svůj izoelektrický bod (pI), což je takové pH prostředí, ve kterém je elektricky neutrální, nepohybuje se v elektrickém poli. V pH prostředí vyšším než pI má záporný náboj a pohybuje se ke kladné elektrodě, anodě, v pH nižším než izoelektrický bod se s kladným nábojem pohybuje ke katodě. Pomůckou pro zapamatování může být zkratka KKK: kyselejší prostředí-kladný náboj-katoda. 

Obr. 25 Chování amfoterních látek při různém pH prostředí, schematicky znázorněn polypeptid.

Vytvoříme-li pohybujícím amfolytům prostředí gradientu pH (pH se postupně mění) dostane se amfolyt do pH prostředí, které odpovídá jeho izoelektrickému bodu pI, jeho postup se zastaví (fokusuje) a vytváří se ostrá zóna. To je princip izoelektrické fokusace. Při vlastním provedení je dělící vrstva na nosiči (např.agaróza, polyakrylamid) napuštěna speciální pufrem (Ampholine) tak, aby se na desce měnilo rovnoměrně pH (gradient pH). V anodovém prostoru je pufr s nižším pH  (1M H₃PO₄), v katodovém pufr s vyšším pH(1M NaOH). 

Obr. 26  Izoelekrtická fokusace, látky s izoelektrickým bodem pI = 5 a pI= 7.

Po skončeném dělení následuje fixace, vysušení a odbarvení elektroforeogramu. Kalibrační graf je určen proteiny se známými isoelektrickými body nebo měřením pH přímo na desce. K přednostem metody patří vysoká ostrost dělení, která je dána fokusací v jednotlivých zónách a tím vysoká rozlišovací schopnost metody. Lze dělit komponenty s rozdílem pI 0,02. K nevýhodám patří větší nákladnost , zdlouhavost a nebezpečí precipitace složek v blízkosti izoelektrických bodů, kde mají nejmenší rozpustnost. Praktické využití této metody je v současné době v analýze séra a mozkomíšního moku ke stanovení tak zvaných oligoklonálních proužků. Dále se dá využít k  podrobné analýze bílkovin ve tkáních, k dělení izoenzymů, ke stanovení glykovaného hemoglobinu, k určení subfrakcí imunoglobulinů, ke stanovení hodnoty izoelektrického bodu, k izolaci čistých bílkovin (preparativní IEF). Zajímavé je i dvojrozměrné provedení, kdy se nejprve v jednom směru provede na polyakrylamidu bez sodium dodecylsufátu (SDS) izoelektrická fokusace (dělení podle pI) a potom se v druhém směru se na polyakrylamidu s SDS provede elektroforéza (dělení podle velikosti molekul). Tímto způsobem se dají rozlišit bílkoviny lišící se pouze v několika aminokyselinách. Tento způsob se používá v proteomických analýzách.

5. Imunochemické metody

Základem imunochemických metod je reakce mezi antigenem (Ag) a specifickou protilátkou (Ab)  za vzniku imunokomplexu (Ag-Ab). Pomocí těchto metod můžeme stanovit jak antigen, tak i protilátky. Na imunochemickou reakci často navazují další reakce, antigen nebo protilátka mohou být značeny nějakým zesilujícím prvkem (enzymem, izotopem, fluoreskující látkou), vyvolávajícím, barevnou reakci, záření, fluorescenci, kterou měříme.

K výhodám imunochemických metod patří hlavně jejich specifita, citlivost, jednoduchost provedení, některé metody lze automatizovat a mohou být k dispozici i pro statimové požadavky. Při jejich aplikaci není nutné zařazovat složité separační postupy a výsledky nebývají ovlivňovány např. hemolýzou vzorku. 

5.1. Základní pojmy

Antigeny  (Ag) jsou látky, které jsou schopny vyvolat v živém organismu, pro který jsou látkou cizorodou, tvorbu specifických protilátek. Nekompletní antigen (hapten) vyvolá tvorbu protilátek pouze v případě, je-li navázán na bílkovinný nosič (hapteny – léčiva, hormony, steroidy, izolované determinantní skupiny antigenu)

Protilátky (Ab) – bílkoviny vykazující specifickou vazebnou aktivitu vůči antigenu na jehož podnět se vytvořily (imunoglobuliny).Jsou tvořeny aktivovanými B-lymfocyty (plazmocyty). 

Antiséra – komerčně vyrobené protilátky (imunizace zvířat)

Polyvalentní antiséra – protilátky proti mnoha bílkovinám.

Monovalentní antiséra – protilátky proti jedné stanovované bílkovině.

Polyklonální protilátky – heterogenní směs proti jednotlivým skupinám (epitopům) antigenu a jsou tvořeny mnoha klony B lymfocytů, z hlediska svých vlastností jsou heterogenní. Příprava- imunizací zvířat (příprava čistého antigenu, jeho konjugace imunizace a odběr antiséra).

Monoklonální protilátky – reagují pouze proti jedné antigenní determinantní skupině antigenu, produkt jednoho klonu B lymfocytů, jsou naprosto homogenní a přísně specifické proti jedinému epitopu. Vhodný nástroj přesné diagnostiky. 

Kompetitivní (soutěživé) - antigen a značený antigen soutěží o místa na protilátce, která je v limitovaném množství, ne na každý antigen a značený antigen se dostane.Měříme-li signál značky vázané v imunokomplexu Ab-Ag^M je naměřená hodnota nepřímo úměrná koncentraci stanoveného antigenu.

Nekompetitivní (nesoutěživé) - při stanovení antigenu je specifická protilátka v nadbytečném množství, značená druhá protilátka je rovněž v nadbytku. Hladina měřeného signálu je přímo úměrná stanovovanému antigenu.

Homogenní metody - volný značený antigen, nebo značená protilátka mají odlišné fyzikálně-chemické vlastnosti od stejně značeného antigenu nebo značené protilátky vázané v imunokomplexu antigen-protilátka. Při měření signálu této vlastnosti nemusíme oddělovat volné značené složky od těchto složek vázaných v imunokomplexech.

Heterogenní metody -.vazbou do imunokomplexu se měřené  vlastnosti, nebo chování, nemění a v analytickém postupu je vždy vložen separační krok na oddělení značených volných a vázaných komponent imunochemické reakce. 

Obr. 27  Schema kompetitivního stanovení antigenu.(Ag). V případě, že měříme hodnotu signálu, kterou dává zesilující prvek v poli 1, jde o nepřímou úměru, čím více stanovovaného antigenu, tím menší signál (zesilovací prvek označený hvězdičkou může být enzym, fluorofor,luminiscenční značka, izotop). Značený antigen v poli 2 musíme u heterogenních metod odstranit. Protilátka Ab je v limitovaném množství. Toto je základní schema, provedení  může být různé.

Obr. 28 Nekompetitivní stanovení antigenu. Obě protilátky jsou v nadbytečném množství, antigen má pro ně dvě různá vazebná místa. Přebytek protilátek v poli 2 je odstraněn, signál je přímo úměrný stanovovanému antigenu. Opět jde pouze o jeden příklad z řady jiných možností uspořádání

5.2. Aglutinační metody

Antigen vázaný na buňky nebo na mikročástice se specifickou protilátkou aglutinuje.Toho se využívá k např. průkazu protilátek vázaných na povrch červených krvinek. (Coombsův test). Nejprve musí být krvinky promyty a potom se inkubují s protilátkami proti lidským imunoglobulinům. Pokud dojde k viditelné aglutinaci červených krvinek, jsou na povrchu krvinek navázány  protilátky. Na principu aglutinace jsou na transfuzních odděleních vyšetřovány červené krvinky dárce proti plazmě příjemce. Nepřítomnost aglutinace je podmínkou pro použití krvinek dárce. 

K zesílení měřené turbidity se také někdy využívají mikročástice potažené antigenem, které při reakci s protilátkou rychle aglutinují.  Příkladem může být stanovení amikacinu v séru nebo v plazmě metodou označovanou jako PETINIA  (Particle Enhanced Turbidimetric INhibition ImunoAssay). Metoda je založena na soutěži (kompetici) mezi amikacinem ve vzorku s amikacinem, kterým jsou potažené mikročástice s protilátkou. Mikročástice vazbou s protilátkou rychle aglutinují a vytváří zákal měřený turbidimetricky. Je zde nepřímá úměra mezi koncentrací amikacinu ve vzorku s měřenou turbiditou

Obr. 29  Schema metody označované jako PETINIA 

5.3. Enzymové imunoanalýzy (EIA)

Enzymy jako indikátory se začaly používat od roku 1971 a postupně nahrazovaly v některých analýzách značení radionuklidem. Enzym je chemicky (kovalentně) vázán (konjugován) na některý imunoreaktant (antigen, hapten, protilátku). V takto připraveném  enzymovém konjugátu musí mít použitý imunoreaktant zachovány své původní imunospecifické vlastnosti, tedy antigeny své determinanty a protilátky svá vazebná místa. Uspořádání může být homogenní v kapalné fázi nebo heterogenní za použití pevné fáze.  

Požadavky na enzym:           

1.  enzym musí být stabilní
2.  má snadno měřitelnou vysokou katalytickou aktivitu
3.  nesmí se vyskytovat v měřeném vzorku séra
4.  vysoký signál po koncové reakci
5.  musí si zachovat svou aktivitu i po vazbě s ligandem (kromě některých homogenních   metod), toto splňují lépe enzymy s nižší relativní molekulovou hmotností
6.  musí být snadno dostupný ve vhodné kvalitě

Těmto požadavkům vyhovuje například nejčastěji používané: křenová peroxidáza (ang. horse radish peroxidase, zkratka HRP), využívaná jako značka prakticky ve všech metodách ELISA na mikrotitračních destičkách. Nejčastěji používaný substrát pro tento enzym  je tetramethylen benzidin (TMB). na imunochemických analyzátorech se využívá alkalická fosfatáza, se substrátem 4- metylumbelliferyl fosfátem a pod. 

Pro velkou citlivost se stále více uplatňují fluorogenní a chemiluminiscenční substráty, kdy enzym použitý jako značka štěpí tyto substráty za vzniku látky, která má fluorogení nebo luminiscenční vlastnosti. K měření se používají jednoduché spektrofotometry, automatické analyzátory nebo se měří absorbance mikrotitračních destiček.

Enzymové heterogenní imunoanalýzy na pevné fázi

V současné době se v praxi využívají více než homogenní metody. Jeden imunoreaktant  je vázán na pevné fázi a použitím různých technik se po imunochemické reakci provádí separace imunokomplexu od volných značených antigenů nebo protilátek. Jedná se o velkou skupinu heterogenních metod, které mohou být v různém provedení. Dělení může být provedeno z různých hledisek. Některé provedení je kompetivní, jiné na stejném nosiči nekompetitivní. Využívají se různé pevné fáze. Obecně je tato skupina metod označována zkratkou ELISA z anglického „Enzyme Linked ImmunoSorbent  Assay“. U nás si s tímto označením často spojujeme často pouze metody prováděné na mikrotitračních destičkách.

Analýzy na mikrotitračních destičkách

Mikrotitrační destičky mají standardní rozměr 128 x 86 mm a obsahují

96 reakčních jamek v osmi řádcích (A.B.C.D.E.F.G.H) a dvanácti  sloupcích (1-12). Objem jamek je cca 400 ml. Využívají se pro zpracování většího počtu stanovení, většinou počítáme na destičku cca 80 vzorků v singlu, ostatní pozice jsou určeny pro kalibrátory a kontroly. Pro menší počet vzorků jdou obvykle zpracovávat jednotlivé sloupcové fragmenty po osmi jamkách (stripy), které se dají vyjímat. Pro práci s destičkou musíme mít k dispozici vhodný fotometr (reader), který měří po jednotlivých sloupcích. Měření se provádí ve vertikálním směru. Pro rychlé a standardní promývání jsou k dispozici promývačky mikrotitračních destiček, pro míchání horizontální míchačky. Všechny tyto úkony lze dělat spolu s dávkováním vzorků a reagencií na automatech, na kterých lze z jednoho vzorku provést najednou více metod. Některé přístroje mohou zpracovat více mikrotitračních destiček s různými analytickými postupy.

Obr. 30 Příklad stanovení antigenu na mikrotitrační destičce:

      Obr. 31  Příklad stanovení na mikrotitračních destičkách 

1. Mikrotitrační destička s protilátkou proti stanovovanému antigenu
2. Přídavek vzorku, obsahující stanovovaný antigen a další látky, které mohou ovlivňovat další postup. Spolu se vzorkem je často přidáván pufr na zajištění správného prostředí pro vazbu antigenu na protilátku
3. Inkubace mikrotitrační destičky, je možná při laboratorní teplotě nebo 37^o C, v klidu          nebo za stálého míchání. Každá metoda má svůj protokol. Destička se často přikrývá folií
4. Po inkubaci a odtranění folie následuje odsátí a několika násobné promytí destičky (obvykle 3 - 6x) v posledním kroku zůstane destička prázdná. Doporučuje se ještě před dalším krokem destičku vyklepnout na buničinu
5. Do jamek se napipetuje konjugát, druhá protilátka na kterou je vázán konjugační vazbou biotin. Následuje opět inkubace za podmínek protokolu metody.
6. Po inkubaci se opět destička promývá obdobně jako je uvedeno v bodu 4. Promytím se odstraňuje nezreagovaný konjugát, který se přidává v přebytku.
7. Do prázdných jamek se přidává enzym, obvykle křenová peroxidáza vázaná na streptavidin (Stretavidin_HRP). Streptavidin má velkou afinitu k navázanému biotinu, opět se inkubuje podle protokolu metody.
8. Přebytek streptavidinu enzymem, který není vázaný na destičku, se dalším promytím     odstraní (viz bod 4, 6). Všechna promytí mají obvykle stejný design, co se týká počtu cyklů, objemu promývacího pufru, prodlev v jamkách a pod.
9. Do prázdných jamek se přidává substrát (nejčastěji tetramethylenbenzidin TMB).     Substrát je citlivý na přímé světlo a tak se připravuje většinou ze dvou komponent  bezprostředně před použitím, v soupravě se uchovává v tmavých neprůsvitných     lahvičkách. Následuje inkubace, při které vzniká modré zabarvení. Podle intenzity     zabarvení nejkoncentrovanější standardy je možné inkubaci zkrátit, tak že přidáme    činidlo, které reakci zastaví, viz bod 10.
10. Přidáním stop činidla se reakce zastaví a současně s okyselením přeměněného                  substrátu se modré zabarvebí změní na stabilní žluté, vhodné k fotometrickému     stanovení při primární vlnové délce 450 nm a někdy používané sekundární vlnové      délce 610 -650 nm.

MEIA  (Microparticle Enzyme Immunoassay) technika

Jedná se o heterogenní techniku kde je jeden imunoreagent zakotven na pevné fázi. Jako příklad mohou sloužit MEIA techniky stanovení na analyzátoru AxSYM f. Abbott. Slouží ke stanovení antigenů nebo protilátek (vyšší mol. hmotnost). Mikropartikule jsou submikronové latexové částice s vázaným antigenem, protilátkou nebo částicí viru. Částice mají velký povrch, což zrychluje imunochemickou reakci a tím se snižuje inkubační čas. Můžeme pracovat v jednom nebo dvou krocích. Buď se najednou smíchá mikropartikule, vzorek a protilátka  s konjugátem enzymu alkalické fosfatázy, nebo pouze mikropartikule se vzorkem při dvoukrokové metodě. Po inkubaci se přenesou mikrupartikule s imunokomplexem na skleněná vlákna. Zde se provede promytí (u dvoukrokové metody se přidá konjugát s enzymem alkalické fosfatázy a opět následuje promytí). Na skleněná vlákna se potom přidá fluorogenní substrát 4- metylumbelliferyl fosfát (MUP). Alkalická fosfatáza štěpí substrát za vzniku fluorescenčního produktu metylbelliferonu (MU, fluorofor). Měřená fluorescence je přímo úměrná koncentraci měřeného 

analytu.

Využití paramagnetických částic

Paramagnetické částice se využívají v moderních heterogenních  analýzách

k zakotvení antigenu nebo protilátky a po vzniku imunokomplexu se zachycují pomocí magnetického pole na stěny reakčních kyvet. Po zachycení je  možné provést odstranění nezreagovaných značených imunoreagentů a odstranění interferenčních látek dokonalým promytím. Paramagnetické částice tvoří latexové částice obohacené uvnitř o oxidy železa, které tak nejsou v přímém styku s reagenciemi. Při uchovávání mimo přístroj jsou tyto částice usazeny na dně zásobních reagenčních lahviček. Při práci jsou v přístroji před dávkováním vhodným způsobem rozmíchávány.

Tento způsob separace se například využívá u luminiscenčních metod (LIA) s různou detekční koncovkou. Luminofor se může využívat přímo jako značka nebo je součástí substrátu. Vyvolání luminiscence může být enzymatickou přeměnou substrátu, chemicky  (CLIA, CMIA – chemiluminiscent magnetic ) nebo elektrickým impulsem (ELCIA). Příklady využití: CMIA - technologie imunoanalyzátory Architect i2000, i 2000SR firmy ABBOTT, ECLIA - analyzátor Cobas e411firmy Roche. 

⇩

Obr. 32 Jedna z možností uspořádání MEIA stanovení, dvoukroková metoda. 

Fluorescenční polarizační imunoanalýza (FPIA)

Metoda FPIA je využívaná na analyzátoru AxSYM f. Abbott spolu s technikou MEIA, která byla probrána v imunoanalýzách na pevné fázi. FPIA je na rozdíl od MEIA homogenní technikou v kompetitivním uspořádání na menší molekuly (hapteny, drogy, hormony apod.). Měření fluorescence se provádí v polarizovaném světle. Využívá se různé rotace malých a velkých molekul, které vedou ke změně polarizace. Měří se intenzita polarizovaného světla. Fluorofor na malé molekule svou rychlou rotací zeslabí polarizované světlo na rozdíl od fluoroforu na velké molekule. Do reakční kyvety obsahující antigen se přidává v nadbytku antigen značený fluoresceinem (fluorofor) a v limitovaném množství protilátka. Po imunochemické reakci je míra intenzity polarizovaného světla nepřímo úměrná koncentraci stanovovaného antigenu.

Obr. 33  Popis a schema měření FPIA, AxSym, měření menších molekul (drogy,  antibiotika, hormony)

6. Osmometrie

Představme si dva různě koncentrované roztoky, které jsou od sebe odděleny polopropustnou (semipermeabilní) membránou, která je propustná pouze pro rozpouštědlo. Snaha o vyrovnání koncentrací povede k toku rozpouštědla směrem do koncentrovanějšího roztoku. Tomuto jevu se říká osmóza. K zabránění pronikání rozpouštědla musíme vyvinout tlak, kterému říkáme tlak osmotický. 

Obr.  34 Vznik osmotického tlaku 

Osmolalita je veličina závislá pouze na počtu částic v roztoku bez ohledu na jejich velikost. Vyjadřuje se v mmol obsažených v jednom kg rozpouštědla. Jeden mol jakékoliv látky obsahuje stejné množství molekul, které je dané Avogadrovým číslem ( 6,02 * 10²³ částic). Jeden mol glukózy obsahuje stejné množství molekul jako 1 mol chloridu sodného. Chlorid sodný v roztoku disociuje na stejný počet sodných a chloridových iontů. Osmolalita je koncentrační jednotka, která bere v úvahu tento disociační efekt. To znamená, že příspěvek NaCl  bude dvojnásobný ve srovnání se stejnou koncentrací glukózy vyjádřenou v mol/l (ve zředěných roztocích je chlorid sodný prakticky úplně disociován). Jeden mol nedisociované látky jako je glukóza rozpuštěný v 1 kg vody sníží bod tuhnutí o 1,86 °C. Toto číslo je známé jako konstanta snížení bodu tuhnutí pro vodu. U NaCl bude toto snížení vzhledem k disociaci dvojnásobné, tedy 3,72 °C . Tohoto principu (kryoskopie) se nejčastěji využívá k stanovení osmolality. Stupeň disociace se může měnit u některých jiných látek výrazněji například změnou pH roztoku. Tyto změny se promítnou do změřené osmolality. U složitějších roztoků se na snížení bodu tuhnutí podílí všechny nedisociované a disociované částice a koncentraci každé jednotlivé složky roztoku z nich jednotlivě není možné jednoduše vyjádřit. Osmolalita je tedy souhrnné vyjádření koncentrací všech navzájem se ovlivňujících složek. Koncentrace se vyjadřuje v mmol na 1 kg rozpouštědla (mmol/kg). Vyjadřuje se na kg, protože se objem mění s teplotou rozpouštědla. Počet částic ovlivňuje osmotický tlak na membránu, proto by šlo vyjadřovat osmolalitu i v jednotkách tlaku (Pa), tento způsob se v rutinní praxi nepoužívá. Osmolalita plazmy se za fyziologických podmínek pohybuje v rozmezí 285 ± 10 mmol/kg.

Chceme-li odhadnout osmolalitu nebo zjisti přítomnost neznámé osmoticky aktivní látky, můžeme použít následujícího výpočtu osmolality séra. 

           Osmolalita (mmol/kg) = 2 Na⁺ + urea + glukóza  (vše mmol/l)

Na⁺, urea a glukóza jsou pro hodnotu osmolality v plazmě rozhodující, koeficient 2 u Na⁺ zohledňuje anionty plazmy. Vypočtenou osmolalitu srovnáváme s osmolalitou skutečně naměřenou. Rozdíl naměřené a vypočtené osmolality  označujeme jako osmolality gap a udává nám přítomnost osmoticky aktivní látky. Nejčastější osmoticky aktivní látka přítomná v plazmě je etanol. 1 g etanolu/ litr (1 promile etanolu) působí vzestup osmolality o přibližně 22 mmol/kg. (molekulová hmotnost etanolu je 46,07; 1g/l = 21,7 mmol/l ).   

Podobně mohou zvyšovat osmolalitu i jiné látky, hlavně  o malé molekulové hmotnosti např. metanol, etylenglykol [[odkaz na Játra 2.2. a 2.3.]]. Při extrémní nízké nebo vysoké koncentraci bílkovin nebo vysokých lipidech se mění podíl vody v plazmě a výpočet, který počítá s koncentrací látek na 1 litr plazmy nemůže odpovídat změřené hodnotě, která se vztahuje na 1 kg čisté vody. 

7. Polymerázová řetězová reakce (PCR)

Všeobecně používaná zkratka PCR je odvozena z anglického názvu Polymerase Chain Reaction. Představte si, že máme najít nějakou složku ve vzorku, případně stanovit její koncentraci  a ta složka je ve vzorku v tak malé koncentraci, že je pod hranicí stanovitelnosti známých metod. Jakou máme ještě jinou volbu, snad provést nějakou extrakci a zahuštění vzorku, ale co když je ta naše složka příliš citlivá na podobné operace? Pomocí metody PCR dokážeme z nízké koncentrace části úseků DNA replikací dosáhnout takové koncentrace, kterou lze dobře stanovit. Jak je všeobecně známo vyskytuje se DNA jako dvouvláknová šroubovice, kterou lze rozdělit na dvě samostatná vlákna. Naším úkolem obvykle není namnožit celou DNA (celou genetickou informaci organismu), ale jen její část (část nějakého genu). Tuto cílovou část DNA si ohraničíme dvěma krátkými molekulami DNA, které se nazývají primery. Nasedají na začátek a konec množené sekvence. DNA polymeráza syntetizuje druhé komplementární vlákno DNA. Na konci jednoho cyklu máme dvě kopie množené sekvence, každá má jedno původní a druhé nově syntetizované vlákno, celý cyklus se opakuje a DNA se množí geometrickou řadou. Po 30 cyklech namnožíme až miliardu molekul. A to je množství, které se dá již dobře stanovit.

           PCR reakce probíhá v cyklech, přičemž každý cyklus se skládá ze 3 kroků:

•   Denaturace DNA  při 95°C – rozdělení na dvě jednotlivá vlákna
•   Označení příslušného úseku DNA , který chceme DNA polymerázou množit. Označuje se začátek a konec, značky se nazývají primery a pracuje se při teplotách 40 – 65 °C
•   Působení DNA polymerázy, která tvoří při 72 °C druhé vlákno, (využívá se termostabilní bakterielní polymeráza bakterií z horkých pramenů Yellowstonského národního parku

Příklady využití:

• Diagnostika infekčních chorob (virových hepatitid)
• Diagnostika genetických nemocí
•  Identifikace osob, kriminalistika,
• Stanovení otcovství

Obr. 35 Schema PCR

8. Gelová chromatografie

Příklad využití gelové chromatografie v klinické biochemii – stanovení makroamylázy.

Gelová permeační chromatografie (GPC) bývá řazena k rozdělovací chromatografii, která bude podrobněji popsána v jiné části.  K dělení dochází na pórovitém gelu (molekulovém sítu) a rozhodující je velikost dělených molekul. Gel je pevnou fází, pohyblivou kapalnou fází je eluční roztok. Pro tuto metodu se někdy užívá názvu „obrácená filtrace“. Důvod je ten, že z kolony plněné gelem odcházejí, na rozdíl od filtrace, jako první velké molekuly a teprve potom postupně molekuly menší. Podrobněji bude gelová chromatografie popsána v kapitole věnované ostatním chromatografickým  metodám.

Amyláza se vyskytuje v organismu podle původu ve dvou izoenzymech slinném a pankreatickém. Oba tyto izoenzymy mají molekulovou hmotnost přibližně 57 000 Da. Vzhledem k poměrně malé molekule je schopná se filtrovat v glomerulech a přecházet do moče kde její aktivitu také měříme. V některých případech dochází k zvětšení enzymatické aktivity amylázy v plasmě v porovnání s její aktivitou v moči, což je možné ověřit  vypočtením frakční exkrece amylázy (FE _amyl). Při  hodnotách FE _Amyl menších než 0,01 je možné uvažovat na přítomnost makroamylázy v plazmě. Makro forma má hodnotu molekulové hmotnosti vyšší (obvykle nad 150 000 Da). Vhodnou metodou na její průkaz je využití gelové chromatografie na Sephadexu G-100. V jednotlivých frakcích můžeme proměřit aktivitu amylázy a například koncentraci albuminu, který má molekulovou hmotnost 67 000 Da. Makroamylázu vzhledem v velké molekule naměříme v prvních frakcích, normální amyláza se pak bude vyskytovat následujících frakcích přibližně společně s albuminem.  

Obr.  36 Malé částice amylázy vnikají dovnitř vhodně zvoleného gelu (Sephadex S 100) a tím jsou zpomalovány. Makroamyláza, která gel obtéká, opouští kolonu dříve.