Základní principy analytických metod

Všeobecně používaná zkratka PCR je odvozena z anglického názvu Polymerase Chain Reaction. Představte si, že máme najít nějakou složku ve vzorku, případně stanovit její koncentraci  a ta složka je ve vzorku v tak malé koncentraci, že je pod hranicí stanovitelnosti známých metod. Jakou máme ještě jinou volbu, snad provést nějakou extrakci a zahuštění vzorku, ale co když je ta naše složka příliš citlivá na podobné operace? Pomocí metody PCR dokážeme z nízké koncentrace části úseků DNA replikací dosáhnout takové koncentrace, kterou lze dobře stanovit. Jak je všeobecně známo vyskytuje se DNA jako dvouvláknová šroubovice, kterou lze rozdělit na dvě samostatná vlákna. Naším úkolem obvykle není namnožit celou DNA (celou genetickou informaci organismu), ale jen její část (část nějakého genu). Tuto cílovou část DNA si ohraničíme dvěma krátkými molekulami DNA, které se nazývají primery. Nasedají na začátek a konec množené sekvence. DNA polymeráza syntetizuje druhé komplementární vlákno DNA. Na konci jednoho cyklu máme dvě kopie množené sekvence, každá má jedno původní a druhé nově syntetizované vlákno, celý cyklus se opakuje a DNA se množí geometrickou řadou. Po 30 cyklech namnožíme až miliardu molekul. A to je množství, které se dá již dobře stanovit.

           PCR reakce probíhá v cyklech, přičemž každý cyklus se skládá ze 3 kroků:

•   Denaturace DNA  při 95°C – rozdělení na dvě jednotlivá vlákna
•   Označení příslušného úseku DNA , který chceme DNA polymerázou množit. Označuje se začátek a konec, značky se nazývají primery a pracuje se při teplotách 40 – 65 °C
•   Působení DNA polymerázy, která tvoří při 72 °C druhé vlákno, (využívá se termostabilní bakterielní polymeráza bakterií z horkých pramenů Yellowstonského národního parku

Příklady využití:

• Diagnostika infekčních chorob (virových hepatitid)
• Diagnostika genetických nemocí
•  Identifikace osob, kriminalistika,
• Stanovení otcovství

Obr. 35 Schema PCR