Základní principy analytických metod

Enzymy jako indikátory se začaly používat od roku 1971 a postupně nahrazovaly v některých analýzách značení radionuklidem. Enzym je chemicky (kovalentně) vázán (konjugován) na některý imunoreaktant (antigen, hapten, protilátku). V takto připraveném  enzymovém konjugátu musí mít použitý imunoreaktant zachovány své původní imunospecifické vlastnosti, tedy antigeny své determinanty a protilátky svá vazebná místa. Uspořádání může být homogenní v kapalné fázi nebo heterogenní za použití pevné fáze.  

Požadavky na enzym:           

1.  enzym musí být stabilní
2.  má snadno měřitelnou vysokou katalytickou aktivitu
3.  nesmí se vyskytovat v měřeném vzorku séra
4.  vysoký signál po koncové reakci
5.  musí si zachovat svou aktivitu i po vazbě s ligandem (kromě některých homogenních   metod), toto splňují lépe enzymy s nižší relativní molekulovou hmotností
6.  musí být snadno dostupný ve vhodné kvalitě

Těmto požadavkům vyhovuje například nejčastěji používané: křenová peroxidáza (ang. horse radish peroxidase, zkratka HRP), využívaná jako značka prakticky ve všech metodách ELISA na mikrotitračních destičkách. Nejčastěji používaný substrát pro tento enzym  je tetramethylen benzidin (TMB). na imunochemických analyzátorech se využívá alkalická fosfatáza, se substrátem 4- metylumbelliferyl fosfátem a pod. 

Pro velkou citlivost se stále více uplatňují fluorogenní a chemiluminiscenční substráty, kdy enzym použitý jako značka štěpí tyto substráty za vzniku látky, která má fluorogení nebo luminiscenční vlastnosti. K měření se používají jednoduché spektrofotometry, automatické analyzátory nebo se měří absorbance mikrotitračních destiček.

Enzymové heterogenní imunoanalýzy na pevné fázi

V současné době se v praxi využívají více než homogenní metody. Jeden imunoreaktant  je vázán na pevné fázi a použitím různých technik se po imunochemické reakci provádí separace imunokomplexu od volných značených antigenů nebo protilátek. Jedná se o velkou skupinu heterogenních metod, které mohou být v různém provedení. Dělení může být provedeno z různých hledisek. Některé provedení je kompetivní, jiné na stejném nosiči nekompetitivní. Využívají se různé pevné fáze. Obecně je tato skupina metod označována zkratkou ELISA z anglického „Enzyme Linked ImmunoSorbent  Assay“. U nás si s tímto označením často spojujeme často pouze metody prováděné na mikrotitračních destičkách.

Analýzy na mikrotitračních destičkách

Mikrotitrační destičky mají standardní rozměr 128 x 86 mm a obsahují

96 reakčních jamek v osmi řádcích (A.B.C.D.E.F.G.H) a dvanácti  sloupcích (1-12). Objem jamek je cca 400 ml. Využívají se pro zpracování většího počtu stanovení, většinou počítáme na destičku cca 80 vzorků v singlu, ostatní pozice jsou určeny pro kalibrátory a kontroly. Pro menší počet vzorků jdou obvykle zpracovávat jednotlivé sloupcové fragmenty po osmi jamkách (stripy), které se dají vyjímat. Pro práci s destičkou musíme mít k dispozici vhodný fotometr (reader), který měří po jednotlivých sloupcích. Měření se provádí ve vertikálním směru. Pro rychlé a standardní promývání jsou k dispozici promývačky mikrotitračních destiček, pro míchání horizontální míchačky. Všechny tyto úkony lze dělat spolu s dávkováním vzorků a reagencií na automatech, na kterých lze z jednoho vzorku provést najednou více metod. Některé přístroje mohou zpracovat více mikrotitračních destiček s různými analytickými postupy.

Obr. 30 Příklad stanovení antigenu na mikrotitrační destičce:

      Obr. 31  Příklad stanovení na mikrotitračních destičkách 

1. Mikrotitrační destička s protilátkou proti stanovovanému antigenu
2. Přídavek vzorku, obsahující stanovovaný antigen a další látky, které mohou ovlivňovat další postup. Spolu se vzorkem je často přidáván pufr na zajištění správného prostředí pro vazbu antigenu na protilátku
3. Inkubace mikrotitrační destičky, je možná při laboratorní teplotě nebo 37^o C, v klidu          nebo za stálého míchání. Každá metoda má svůj protokol. Destička se často přikrývá folií
4. Po inkubaci a odtranění folie následuje odsátí a několika násobné promytí destičky (obvykle 3 - 6x) v posledním kroku zůstane destička prázdná. Doporučuje se ještě před dalším krokem destičku vyklepnout na buničinu
5. Do jamek se napipetuje konjugát, druhá protilátka na kterou je vázán konjugační vazbou biotin. Následuje opět inkubace za podmínek protokolu metody.
6. Po inkubaci se opět destička promývá obdobně jako je uvedeno v bodu 4. Promytím se odstraňuje nezreagovaný konjugát, který se přidává v přebytku.
7. Do prázdných jamek se přidává enzym, obvykle křenová peroxidáza vázaná na streptavidin (Stretavidin_HRP). Streptavidin má velkou afinitu k navázanému biotinu, opět se inkubuje podle protokolu metody.
8. Přebytek streptavidinu enzymem, který není vázaný na destičku, se dalším promytím     odstraní (viz bod 4, 6). Všechna promytí mají obvykle stejný design, co se týká počtu cyklů, objemu promývacího pufru, prodlev v jamkách a pod.
9. Do prázdných jamek se přidává substrát (nejčastěji tetramethylenbenzidin TMB).     Substrát je citlivý na přímé světlo a tak se připravuje většinou ze dvou komponent  bezprostředně před použitím, v soupravě se uchovává v tmavých neprůsvitných     lahvičkách. Následuje inkubace, při které vzniká modré zabarvení. Podle intenzity     zabarvení nejkoncentrovanější standardy je možné inkubaci zkrátit, tak že přidáme    činidlo, které reakci zastaví, viz bod 10.
10. Přidáním stop činidla se reakce zastaví a současně s okyselením přeměněného                  substrátu se modré zabarvebí změní na stabilní žluté, vhodné k fotometrickému     stanovení při primární vlnové délce 450 nm a někdy používané sekundární vlnové      délce 610 -650 nm.

MEIA  (Microparticle Enzyme Immunoassay) technika

Jedná se o heterogenní techniku kde je jeden imunoreagent zakotven na pevné fázi. Jako příklad mohou sloužit MEIA techniky stanovení na analyzátoru AxSYM f. Abbott. Slouží ke stanovení antigenů nebo protilátek (vyšší mol. hmotnost). Mikropartikule jsou submikronové latexové částice s vázaným antigenem, protilátkou nebo částicí viru. Částice mají velký povrch, což zrychluje imunochemickou reakci a tím se snižuje inkubační čas. Můžeme pracovat v jednom nebo dvou krocích. Buď se najednou smíchá mikropartikule, vzorek a protilátka  s konjugátem enzymu alkalické fosfatázy, nebo pouze mikropartikule se vzorkem při dvoukrokové metodě. Po inkubaci se přenesou mikrupartikule s imunokomplexem na skleněná vlákna. Zde se provede promytí (u dvoukrokové metody se přidá konjugát s enzymem alkalické fosfatázy a opět následuje promytí). Na skleněná vlákna se potom přidá fluorogenní substrát 4- metylumbelliferyl fosfát (MUP). Alkalická fosfatáza štěpí substrát za vzniku fluorescenčního produktu metylbelliferonu (MU, fluorofor). Měřená fluorescence je přímo úměrná koncentraci měřeného 

analytu.

Využití paramagnetických částic

Paramagnetické částice se využívají v moderních heterogenních  analýzách

k zakotvení antigenu nebo protilátky a po vzniku imunokomplexu se zachycují pomocí magnetického pole na stěny reakčních kyvet. Po zachycení je  možné provést odstranění nezreagovaných značených imunoreagentů a odstranění interferenčních látek dokonalým promytím. Paramagnetické částice tvoří latexové částice obohacené uvnitř o oxidy železa, které tak nejsou v přímém styku s reagenciemi. Při uchovávání mimo přístroj jsou tyto částice usazeny na dně zásobních reagenčních lahviček. Při práci jsou v přístroji před dávkováním vhodným způsobem rozmíchávány.

Tento způsob separace se například využívá u luminiscenčních metod (LIA) s různou detekční koncovkou. Luminofor se může využívat přímo jako značka nebo je součástí substrátu. Vyvolání luminiscence může být enzymatickou přeměnou substrátu, chemicky  (CLIA, CMIA – chemiluminiscent magnetic ) nebo elektrickým impulsem (ELCIA). Příklady využití: CMIA - technologie imunoanalyzátory Architect i2000, i 2000SR firmy ABBOTT, ECLIA - analyzátor Cobas e411firmy Roche. 

⇩

Obr. 32 Jedna z možností uspořádání MEIA stanovení, dvoukroková metoda. 

Fluorescenční polarizační imunoanalýza (FPIA)

Metoda FPIA je využívaná na analyzátoru AxSYM f. Abbott spolu s technikou MEIA, která byla probrána v imunoanalýzách na pevné fázi. FPIA je na rozdíl od MEIA homogenní technikou v kompetitivním uspořádání na menší molekuly (hapteny, drogy, hormony apod.). Měření fluorescence se provádí v polarizovaném světle. Využívá se různé rotace malých a velkých molekul, které vedou ke změně polarizace. Měří se intenzita polarizovaného světla. Fluorofor na malé molekule svou rychlou rotací zeslabí polarizované světlo na rozdíl od fluoroforu na velké molekule. Do reakční kyvety obsahující antigen se přidává v nadbytku antigen značený fluoresceinem (fluorofor) a v limitovaném množství protilátka. Po imunochemické reakci je míra intenzity polarizovaného světla nepřímo úměrná koncentraci stanovovaného antigenu.

Obr. 33  Popis a schema měření FPIA, AxSym, měření menších molekul (drogy,  antibiotika, hormony)