Základní principy analytických metod

Izoelektrická fokusace slouží k separaci amfolytů (aminokyselin, peptidů, proteinů), kdy pH prostředí, ve kterém se tato látka nachází, rozhoduje o jejich náboji. Každý amfolyt má svůj izoelektrický bod (pI), což je takové pH prostředí, ve kterém je elektricky neutrální, nepohybuje se v elektrickém poli. V pH prostředí vyšším než pI má záporný náboj a pohybuje se ke kladné elektrodě, anodě, v pH nižším než izoelektrický bod se s kladným nábojem pohybuje ke katodě. Pomůckou pro zapamatování může být zkratka KKK: kyselejší prostředí-kladný náboj-katoda. 

Obr. 25 Chování amfoterních látek při různém pH prostředí, schematicky znázorněn polypeptid.

Vytvoříme-li pohybujícím amfolytům prostředí gradientu pH (pH se postupně mění) dostane se amfolyt do pH prostředí, které odpovídá jeho izoelektrickému bodu pI, jeho postup se zastaví (fokusuje) a vytváří se ostrá zóna. To je princip izoelektrické fokusace. Při vlastním provedení je dělící vrstva na nosiči (např.agaróza, polyakrylamid) napuštěna speciální pufrem (Ampholine) tak, aby se na desce měnilo rovnoměrně pH (gradient pH). V anodovém prostoru je pufr s nižším pH  (1M H₃PO₄), v katodovém pufr s vyšším pH(1M NaOH). 

Obr. 26  Izoelekrtická fokusace, látky s izoelektrickým bodem pI = 5 a pI= 7.

Po skončeném dělení následuje fixace, vysušení a odbarvení elektroforeogramu. Kalibrační graf je určen proteiny se známými isoelektrickými body nebo měřením pH přímo na desce. K přednostem metody patří vysoká ostrost dělení, která je dána fokusací v jednotlivých zónách a tím vysoká rozlišovací schopnost metody. Lze dělit komponenty s rozdílem pI 0,02. K nevýhodám patří větší nákladnost , zdlouhavost a nebezpečí precipitace složek v blízkosti izoelektrických bodů, kde mají nejmenší rozpustnost. Praktické využití této metody je v současné době v analýze séra a mozkomíšního moku ke stanovení tak zvaných oligoklonálních proužků. Dále se dá využít k  podrobné analýze bílkovin ve tkáních, k dělení izoenzymů, ke stanovení glykovaného hemoglobinu, k určení subfrakcí imunoglobulinů, ke stanovení hodnoty izoelektrického bodu, k izolaci čistých bílkovin (preparativní IEF). Zajímavé je i dvojrozměrné provedení, kdy se nejprve v jednom směru provede na polyakrylamidu bez sodium dodecylsufátu (SDS) izoelektrická fokusace (dělení podle pI) a potom se v druhém směru se na polyakrylamidu s SDS provede elektroforéza (dělení podle velikosti molekul). Tímto způsobem se dají rozlišit bílkoviny lišící se pouze v několika aminokyselinách. Tento způsob se používá v proteomických analýzách.