Základní principy analytických metod

Elektroforéza  se používá  k rozdělení bílkovin krevního séra, močí, v kombinaci s imunochemickými metodami k průkazu paraproteinů, pomocí elektroforézy se rozdělují i fragmenty DNA po polymerázové řetězové reakci a také se užívá v proteomických analýzách.

Při volné elektroforéze docházelo k difúzi dělených iontů, a proto se nyní používá převážně elektroforéza na nosiči, která se nazývá zónová elektroforéza. Katodový, anodový prostor a elektroforetická komora jsou naplněny základním elektrolytem a dělené složky jsou během separace fixovány na nosiči napuštěném elektrolytem. Základní zařízení pro elektroforézu jsou elektroforetická komora a zdroj stejnosměrného proudu.

Jaké vlastnosti by měl mít nosič:

• neměl by klást odpor při migraci částic
• měl by být chemicky inertní vůči separovaným složkám, rozpouštědlu a detekčnímu činidlu

Při některých elektroforetických metodách využíváme nosiče, které se aktivně podílejí na dělení. Například agarozové gely jsou využívány v imunoelektroforetických metodách, polyakrylamidové gely se dají připravit s různým síťováním a dělení probíhá jednak podle velikosti náboje a také podle velikosti molekul. Který efekt se uplatňuje více závisí na vlastnostech dělených molekul a na gelu.

     Výsledný pohyb částic při dělení je daný součtem elektroforetické a elektroosmotické pohyblivosti. Elektroosmotická  pohyblivost (elektroendoosmóza) závisí na druhu nosiče, na potenciálním spádu, iontové síle a pH použitého pufru. Při dělení směrem ke kladnému pólu, anodě, působí proti směru elektroforetické síly. Jedná se o tok částic s kladným nábojem směrem ke katodě. Je-li elektroosmotický tok vyšší než elektroforetická síla působící na danou částici, je částice unášena tímto tokem směrem ke katodě. Elektroosmotickým tokem jsou unášeny nejvíce velké částice s relativně malým negativním nábojem (imunoglobuliny). Tento jev je možný u některých typů analýz využívat. Silnější je u nosičů, které mají hodné polárních skupin (agar).   

Obr.  22 Působení elektroforetické a elektroosmotické síly na dělené látky. U nosiče, který má hodně polárních skupin např. agaru jsou anionty fixovány na nosiči a kationty (nejen vodíkové ionty) jsou při vložení elektrického napětí pohyblivé, vzhledem k náboji se pohybují ke katodě a působí proti elektroforetické síle. Při malém relativním náboji převáží elektroendoosmoza nad elektroforetickou silou a záporně nabitá látka se pohybuje ke katodě. Katoda i anoda jsou ponořeny do stejného elektrolytu, který je pomocí můstků vodivě spojen  s nosičem. Tohoto zpětného pohybu u imunoglobulinů je možné využívat v některých imunoforetických metodách.