Základní principy analytických metod

Některé látky dovedou přeměnit část pohlcené energie na záření. Této vlastnosti látek se využívá u moderních analytických metod.Tyto metody dělíme podle toho, jakým způsobem  je dodávaná energie na:

• Fotoluminiscenční - k excitaci dochází absorpcí elektromagnetického záření
• Chemiluminiscenční - excitace je způsobena energií chemických reakcí
• Elektroluminiscenční -  energie dodána v podobě elektrického pole nebo

         elektrického proudu

Fluorescenční metody

V klinické biochemii se často používají fluorescenční metody, které patří do  fotoluminiscenčních metod a jsou z hlediska detekce citlivější než absorpční metody. V průměru jsou fluorescenční metody o dva až čtyři řády citlivější než absorpční spektrofotometrie. 

Podle střední doby života excitovaného stavu dělíme fotoluminiscenci na:

• metody s krátkým dosvitem 10^-8 s až 10^-5 s -   fluorescenci
• metody s dlouhým dosvitem 10^-2 s a více -  fosforescenci 

Nejčastěji se měří fluorescence ve viditelné a UV oblasti. Energie emitovaného záření je vždy menší než energie excitačního záření, část energie se ztrácí ve formě tepla, přechodem na nejnižší vibrační hodnotu excitovaného stavu. Rozdíl mezi energií excitace a emise se projevuje posunem vlnové délky mezi excitačním a emisním zářením k vyšším vlnovým délkám u emise. Při fluorescenci je vlnová délka vyšší průměrně o 30 – 50 nm, při fosforescenci je tento posun vyšší (až 200 nm). Emitované záření má podobné charakteristické spektrum jako absorpční spektrum posunuté k nižším energiím, to znamená k větším vlnovým délkám (viz obr.1, tab.1).

Při hledání optima podmínek měření fluorescence můžeme na některých přístrojích proměřit celá spektra. Excitační (aktivační) spektrum je závislost fluorescence (emise) na vlnové délce excitačního záření, která se průběžně mění. Z tohoto spektra určujeme většinou takovou vlnovou délku, při které je maximální emise. Emisní (fluorescenční) spektrum se proměřuje při konstantním excitačním záření, a určuje optimální (maximální) vlnovou délku emise.  

Obr.  15 Fluorimetrické měření 

Kvantový výtěžek fluorescence (QF ) - charakterizuje fluoreskující látku a je mírou intenzity emise. 

QF = energie emitovaná / absorbovaná = N_em/ N_ext

0 – látka nefluoreskuje, hodnota se blíží 1 - látka intenzivně fluoreskuje

Intenzita fluorescenčního toku  je přímo úměrná :

• Intenzitě zářivé energie budícího zdroje
• Molárnímu absorpčního koeficientu fluoreskující látky
• Kvantovému výtěžku fluorescence
• Koncentraci fluoreskující látky

Závislost  je lineární pouze pro velmi nízké koncentrace, při vyšších dochází k zakřivení směrem k ose koncentrace, to znamená, že pro dvě různé koncentrace můžeme naměřit stejné hodnoty fluorescence. Pro daný systém a přístroj je nutné stanovit experimentálně závislost fluorescence na koncentraci a vymezit lineární rozsah. Jev, kdy dochází k zeslabení fluorescence, nazýváme zhášení fluorescence a může být způsobeno:

• koncentračním zhášením, větší počet srážek mezi excitovanými molekulami a molekulami v základním stavu, čím se uvolní energie v nezářivé formě.
• vnitřním filtračním efektem
• zeslabením budícího záření absorpcí roztoku
• absorpcí sekundárního emitovaného záření jinými sloučeninami roztoku
• u koncentrovaného roztoku nejsou excitovány molekuly fluoroforu v celé hloubce
• důležitá je čistota rozpouštědel (voda v polyethylenových nádobách). Chemikálie mohou fluorescenci nejen zhášet, ale i vyvolat, vždy je nutné proměřit slepou zkoušku.
• nejčastějším zhášedlem fluorescence je molekulární kyslík

Citlivost fluorimetrických stanovení vzrůstá s rostoucí intenzitou excitačního, primárního záření. Velikost signálu je ve fluorimetrii v lineární oblasti přímo úměrná koncentraci a vyjadřuje se v jednotkách RFU (relativní fluorescenční jednotky). Principu fluorimetrie se využívá u fluorimetrických detektorů v HPLC, fluorescenční značka je často využívaná u imunochemických metod, fluorescenční mikroskopie nebo u  průtokové cytometrie.

Obr. 16  Měření fluorescence mikrotitračních destiček.Fluorimetr se opatří nástavcem na mikrotitrační destičku. Na obrázku je znázorněn pouze jeden strip destičky a naznačen pohyb destičky pod zdroj excitačního záření, které propouští excitační filtr (modrá šipka), fluorochrom v mikrotitrační destičce emituje záření (zelená šipka), které propouští emisní filtr na detektor. Červená přerušovaná šipka znázorňuje odfiltrované emisní záření (může být z jiného pro nás neměřeného fluorochromu). Když si představíme místo mikrotitrační destičky fluorogenní mikroskopický preparát, místo optického zařízení objektiv a  místo detektoru emisního záření okulár, máme před sebou jednu s možných konstrukcí fluorescenčního mikroskopu.