Základní principy analytických metod

Absorpce světla se využívá v biochemických stanoveních nejdůležitějších látek obsažených v biologických tekutinách. Jen málo látek můžeme stanovit takzvanou přímou spektrofotometrií. Jako příklad takové látky je stanovení bilirubinu u novorozenců. Je tomu tak proto, že bilirubin absorbuje při určité vlnové délce a sérum novorozenců ještě neobsahuje žádné látky, které by absorbovaly při této vlnové délce a tím stanovení rušily. Jakmile je novorozenec přiživován, může sérum obsahovat absorbující látky a přímá spektrofotometrie není možná. Většinu látek stanovujeme po přídavku nějakého činidla, které reaguje s látkou, kterou chceme stanovit, a vytváří produkt, který specificky absorbuje v určité oblasti viditelného nebo ultrafialového spektra. Při vzniku barevného produktu můžeme z výše uvedené tabulky usuzovat na vlnovou délku, kterou lze při spektrofotometrických stanoveních využít. Prakticky vždy je naší snahou použít takovou vlnovou délku světla, které je co nejvíce absorbované. Při této vlnové délce je nejvyšší citlivost měření. Máme-li tedy měřit žluté produkty reakce, použijeme vlnovou délku cca 450 nm, modrý filtr. Bezbarvé roztoky mohou absorbovat neviditelné ultrafialové záření 340 nm.

Obr. 1  Absorbce světla v kyvetě, pojem transmitance (propustnost)

Zářivý tok  φ₀  je při dopadu na kyvetu s barevným roztokem ochuzen o odražené, rozptýlené a absorbované záření. Z kyvety nám tedy vystupuje zeslabený zářivý tok  φ ,  který můžeme měřit. Relativní část prošlého záření  vyjádřená v procentech se nazývá transmitance (propustnost) T.

Transmitance se mění inverzně, se stoupající koncentrací absorbujících produktů klesá, a to logaritmicky (obr.2)  Z tohoto důvodu byl zaveden záporný logaritmus transmitance, který se nazývá absorbance. Závislost absorbance na koncentraci je lineární (obr.3). Na tomto obrázku modrá přímka neprochází počátkem, to znamená, že slepá zkouška, která neobsahuje žádný měřený analyt, má při zvolené vlnové délce nějakou hodnotu absorbance. Měřením proti slepé zkoušce se přímka posune k nule, znázorněno šipkou.

A  = -  log T

Absorbance je bezrozměrné číslo, které může nabývat hodnot od nuly (T=100%), maximální propustnost, až k nekonečnu, při prakticky nulové propustnosti.

Pro nás je důležité, že absorbance je přímo úměrná koncentraci a tloušťce absorbující vrstvy. Tento vztah je vyjádřen Lambert-Beerovým (L.B.) zákonem, kde konstanta úměrnosti je  molární absorpční koeficient (ε ):

                        A =  ε . c . d   

ε  = molární absorpční koeficient, je konstanta charakteristická pro měřenou látku. Při  

      platnosti L.B. zákona je  nezávislá na koncentraci absorbující látky. 

     c  = látková koncentrace (mol/l)

d  = tloušťka absorbujícího prostředí (kyvety) (cm)

A  = absorbance (bezrozměrné číslo)

Obr. 2  Závislost transmitance na koncentraci

:

Obr. 3: Závislost absorbance na koncentraci             

Zákon L.B. je zákonem mezním, tj. platí:

• pro monochromatické světlo
• pro zředěné roztoky (koncentrace absorbující látky musí být menší než 0,01 mol)
• za předpokladu, že absorbující částice nepodléhají žádným změnám (interakcím)
• za předpokladu, že v měřeném roztoku je pouze jedna absorbující složka (aditivita absorbancí)

Odchylky od Lambert-Beerova zákona nastávají:

• V roztocích, kde změnou koncentrace analyzované složky se mění chemická rovnováha
• Ve značně koncentrovaných roztocích, kde dochází ke změně indexu lomu a tomu odpovídá odchylka od lineárního průběhu
• V roztocích  s koloidními částicemi (odraz a rozptyl), nespecifická absorpce s difuzním rozptylem, falešná absorpce záření, zvýšení intenzity sekundárním rozptylem ve směru paprsku
• Při fluorescenci částic přítomných ve vzorku, sekundárně emitované záření budí dojem, že propustnost je vyšší, absorbance se s rostoucím počtem částic snižuje, lze potlačit vhodným filtrem nebo  bichromatickým měřením
• Ve složité matrici vzorku, pozadí (lipémie, bilirubin, hemoglobin)
• Při nedostatečná monochromatičnosti světla (filtr 10-50 nm, hranol 1 –10 nm, mřížka 0,5-2 nm)
• Při špatně zvolenýchexperimentálních  podmínkách (nedostatečná, nízká konc.činidla, krátká reakční doba atd.)

Obr. 4: Závislost chyby měření na absorbanci

Chyby spojené s měřením absorbance.

Nejpřesnější měření absorbance je v rozmezí transmitance 15 – 65 %, což odpovídá absorbanci mezi  0,2 – 0,8. S většími a menšími hodnotami chyby narůstají. Závislost je znázorněna na 

obr. 4. Nutno podotknout, že kvalitní moderní přístroje dokáží měřit absorbanci do vyšších hodnot a udané rozmezí platí hlavně pro manuální práci, ale snažíme se upravit poměry vzorku a činidel tak, aby chyby byly ve stanoveném rozmezí, které je pro každou metodu jiné.

Absorpční spektrum

    Absorpční spektrum se nejčastěji graficky vyjadřuje jako závislost A na vlnové délce. Získá se měřením A při různých vlnových délkách manuálně, nebo pomocí registrujících automatických spektrofotometrů. Při zavádění metody je dobré znát  spektrum pro vzorek, kalibrační materiál a slepou zkoušku (neobsahuje měřený analyt). Nejlepší kalibrátory jsou ty, které mají podobné složení jako měřené vzorky, zde se dá předpokládat i podobné absorpční spektrum. Vlastní měření se nejčastěji provádí v maximu, kde je nejvyšší hodnota molárního absorpčního koeficientu, a tím největší citlivost a nejmenší chyby při nedostatečné monochromatičnosti světla. Na následujících obrázcích (5.,6.) je spektrum redukované (NADH) a oxidované formy (NAD⁺) nikotinamid adenin dinukleotidu. Všimněte si oblasti okolo vlnové délky 340 nm označené šipkou, kde absorbuje pouze redukovaná složka. Vzájemné přeměny oxidované a redukované složky se využívá jako identifikační reakce v celé řadě biochemických stanovení.

Obr.   5 Absorpční spektra NAD⁺  a  NADH , maximum absorbance při vlnové délce  340 nm

             se využívá v optických testech. 

Přístrojové vybavení

Přístroje na měření absorbance se nazývají fotometry. Jako spektrofotometr se obvykle označuje fotometr s lepší spektrální kvalitou záření (mřížka, hranol), často lze na něm zaznamenat automaticky absorpční křivku. Můžeme je dělit na:

• jednopaprskové přístroje, které měří postupně nejdříve neabsorbované záření (slepou zkoušku) a potom absorbanci vlastního vzorku
• dvoupaprskové  přístroje, které porovnávají po průchodu monochromátorem, (viz níže),  dva paprsky, jeden jde přes neabsorbující prostředí slepé zkoušky a druhý současně přes absorbující vzorek.

Základní části spektrofotometrů:

• zdroj zářivé energie
  • žárovka s wolframovým vláknem plněná inertním plynem (krypton, argon, dusík) dává pouze 15% zářivé energie, využívá se hlavně pro viditelnou oblast (VIS)
  • halogenová žárovka obsahuje stopy halogenu k wolframovému vláknu, záření je posunuto do blízké UV oblasti (od 320 nm),.Tento zdroj často využívají spektrofotometry a analyzátory používané v klinických laboratořích
  • výbojky dávají spojité i nespojité záření pro UV-VIS spektrum, jsou to trubičky naplněné plynem nebo parami, proud prochází jako obloukový (doutnavý) výboj a elektron způsobuje excitaci atomů. Nejčastěji využívané: deuteriová výbojka, 

rtuťová výbojka (spektrální Hg lampa), u které využíváme určité vlnové délky dané čarovým spektrem rtuťové výbojky.

• Laser (Light Amplifier by Stimulated Emission of Radiation) v překladu zesílení světla pomocí stimulované emise záření. Výhody tohoto druhu záření:
  • vysoká monochromatičnost světla a frekvenční stabilita
  • malá rozbíhavost 
  • koherentní záření, vlny jsou zfázované, extrémní soustředění záření do úzkého paralelního svazku, laserové paprsky je možné vysílat na značnou vzdálenost
  • příkladem může být helium-neonový plynový laser, vlnová délka  632,8 nm

• disperzní zařízení, monochromátory

Slouží k izolaci úzkého pásma vlnových délek z polychromatického zdroje záření. Čím je užší pásmo vlnové délky, tím je metoda selektivnější, správnější, citlivější a lépe reprodukovatelná při přechodu na jiný analyzátor, který musí mít podobně kvalitní disperzní zařízení. Vlnová délka měření se nejčastěji vybírá v maximu absorpčního spektra měřené látky, kde je metoda nejcitlivější a nejlépe reprodukovatelná. Existují výjimky, kdy se měří mimo maximum, když potřebujeme potlačit současné absorbance interferujících látek nebo posunout absorbanci cíleně k nižším hodnotám. Kvalitu disperzního zařízení hodnotíme podle pološířky, což je rozpětí vlnových délek v polovině maximální propustnosti zařízení. Čím je interval užší, tím je kvalitnější výběr vlnové délky

• filtry (10 - 50 nm)
• hranol 1 - 10 nm)
• reflexní mřížka (0,5 - 2 nm)

Obr.  6 Princip rozkladu světla optickým hranolem, obdobně se rozkládá světlo na 

             kapičkách deště při tvorbě duhy.

• absorpční prostředí
• detektory záření převádějí optický signál na měřitelný elektrický. Používají se jednoduché fotoelektrické články a polovodičové články, které pokrývají celý měřící interval vlnových délek. Na takových zařízeních nazývaných diode array detektory je možno měřit současně při různých vlnových délkách   

Obr.  7 Schema klasického spektrofotometru např. Spekol

Obr.  8 Dioda array detekce, rozklad světla mřížkou až po jeho zeslabení absorpcí vzorkem.Tímto způsobem měří automatické analyzátory, kdy je možné si vybrat současné měření při dvou vlnových délkách (Olympus má 13 diod  v rozsahu vl. délek 340 - 800 nm). Při měření AST (viz níže) používáme primární vlnovou délku 340 nm a sek. 660 nm. 

Postupy pro stanovení koncentrace látek (kalibrace)

Pro stanovení koncentrace základních látek v biologických tekutinách musíme příslušnou metodu kalibrovat. Kalibraci provádíme pomocí standardních roztoků. Nejjednodušší je využití dvou standardních roztoků, kdy jeden standardní vzorek neobsahuje měřenou látku, říkáme mu také slepá zkouška (blank), a druhý standardní vzorek má vhodnou koncentraci sledované látky. Tímto způsobem kalibrace předpokládáme, že  pro stanovení platí Lambert - Beerův zákon.Kalibrační materiál by se měl spektrofotometricky chovat podobně jako vzorek biologického materiálu. Z tohoto důvodu se někdy místo vodných roztoků používají kalibrátory mající obdobné složení jako vzorek se známým obsahem stanovovaných látek. Pomocí takto připravených kalibrátorů můžeme kalibrovat široké spektrum metod, což je výhodné u automatických analyzátorů. Metoda je postavena tak, aby lineární kalibrace vyhovovala pro co největší počet měřených vzorků. V praxi se setkáváme se vzorky, které mají extrémně nízké nebo vysoké hodnoty. Dolní mez stanovitelnosti je dána mezí detekce, která vypovídá o citlivosti metody. Pod mezí stanovitelnosti nevydáváme číselný výsledek,pouze “menší než (< číslo meze stanovitelnosti)”. Horní mez stanovitelnosti nám udává hodnotu, kam až je metoda lineární. 

Opakováním měření předepsaným ředěním se můžeme dostat do mezí, kdy je vzorek správně změřen a číselný výsledek dostaneme po vynásobení faktorem ředění. Na obrázku č. 9 je příklad metody, kde je červenou křivkou vyznačena absorbance v závislosti na stoupající koncentraci. Dolní a horní mezí stanovitelnosti je určený rozsah linearity. V případě vyšších koncentrací je doporučeno ředění vzorku a opakování měření. Výsledek dostaneme vynásobením faktorem ředění. U ještě vyšších extrémních hodnot může být doporučeno větší ředění, nebo se vydává “větší než”. Automatické analyzátory dokáží provést ředění vzorku snížením dávkovaného objemu vzorku a naopak u nízkých hodnot zvětšením objemu vzorku. Výsledky se přepočítávají podle manipulace se vzorkem. Pro nás je důležité si uvědomit, že nejsprávnějších výsledků je dosahováno ve stanovených limitech a každá úprava vzorku přináší větší analytickou chybu a samozřejmě i zdržení způsobené opakováním analýzy. Zacvičený laborant by měl umět vysvětlit důvod, proč je vzorek opakován a extrémní hodnoty hlásit s tím, že výsledek bude upřesněn po opakování například ředěného vzorku. Včasné nahlášení možného extrému je často pro lékaře cennější než čekání na výsledek po opakování. 

Obr.  9 Příklad metody s dolní a horní mezí stanovitelnosti 5 - 60 mmol/l (zelené šipky),  u vzorků s koncentrací vyšší než 60 mmol/l je doporučeno ředění 1:1, opakování měření a výsledek násobit faktorem ředění (F=2) . Při hodnotách nad 120 mmol/l  (červená šipka) nám ani toto ředění nestačí, větší ředění nepoužíváme a výsledek vydáváme > 120 mmol/l .

Obr.  10 Kinetické stanovení s rozdílným složením substrátu. Červená přímka s nižší směrnicí, 

              metoda je méně citlivá. V grafu jsou uvedeny rovnice přímek a hodnoty pro rozdíl 

              0,01 A/min u obou kalibrací.

Musíme se také zmínit o kvalitě vzorku. Kalibrace metody často platí pouze pro vzorek, který není hemolytický, ikterický nebo chylózní. V případě těchto vzorků může docházet například k absorbanci pozadí a dalším ovlivněním, výsledek pak bude zkreslen. Proto má každá metoda stanovena kritéria, kdy lze výsledek vydat, případně je k výsledku připojena varující poznámka. Ordinující lékař nebo sestra by měli být přístupni požadavku laboratoře k zaslání nového vzorku, zvlášť když je povaha vzorku ovlivněna preanalytickou chybou. Všechny rutinní metody jsou v laboratoři kontrolovány na nejméně dvou hladinách v rozmezí normálních, snížených nebo zvýšených hodnot. Když jsou hodnoty kontrol mimo stanovenou mez, provádí se upravení nebo rekalibrace metody opět s následnou kontrolou. 

Některé analyticky složitější metody nejsou lineární a nebo jsou lineární pouze v určitém rozsahu. Takové metody se kalibrují na více standard (až 6) v celém rozmezí. Kalibrační křivka je vyjádřena nějakou složitější matematickou funkcí, kterou jsou schopné moderní analyzátory vypočítat a v celém rozsahu vydávat výsledky.

Průběh reakce

Reakce stanovované látky s činidly probíhá různou rychlostí. Metody jsou velmi často prováděné jako dvoučinidlové. První činidlo označované jako R1 připravuje většinou podmínky pro následnou reakci. Jeho objem bývá větší než činidla R2 a směs vzorek + R1 se určitý  konstantní čas inkubuje. U rutinních analyzátorů (např. Olympus AU) je tato inkubace dlouhá 5 minut. Po této době se přidáním R2 startuje reakce stanovované látky s činidlem (substrátem). V první lag fázi se reakce rozbíhá, potom nastává nárůst absorbance, který se u metod do konečného bodu obvykle zpomaluje. U analyzátorů je tato doba opět 5 minut. Celé stanovení probíhá při konstantní teplotě 37^o C. Automatické analyzátory sledují absorbanci celého průběhu stanovení. Řada analyzátorů Olympus AU má celkem 27 fotometrických měření během uvedené doby 10 minut. Podle průběhu reakce a stanovované látky si můžeme vybrat z celé řady kombinací odečtu absorbancí. 

• jednobodový test do konečného bodu (end point) - měříme jeden bod po prakticky skončené reakci

Obr.  11 Příklad metody end point, stanovení bílkoviny (hodnota75 g/l), AU 2700,  

   dvoučinidlová metoda (R1,R2), měření primární a sekundární vlnové délky, 

   pro výpočet rozdíl absorbancí těchto vlnových délek v 27 fotometrickém bodě 

   (zelená oboustranná šipka), faktor je poměr koncentrace standardu a rozdílu 

   jeho absorbancí

• dvojbodový test - výpočet provádíme z rozdílu absorbancí před přidáním druhého činidla a po proběhlé reakci. Při tomto způsobu je eliminována možná absorbance vlastního vzorku způsobena jeho hemolýzou, chylozitou nebo ikteritou. Další možností je dvoubodové měření po přidání druhého činidla při nelineárním průběhu reakce, příkladem může být Jaffého reakce při stanovení kreatininu viz obr.

Obr. 12  Příklad dvoubodové metody stanovení kreatininu Jaffého reakcí (hodnota 855 μmol/l) , AU 2700, dvoučinidlová metoda (R1,R2), měření primární a sekundární vlnové délky, pro výpočet se využívá měření ve 24. a 13. fotometrickém bodě, měří se při dvou vlnových délkách. K výpočtu se používá rozdílu absorbancí mezi 24. a 13. fotometrickým bodem (je označen černou šipkou), faktor je poměr koncentrace standardu s rozdílem absorbancí měřených stejným způsobem. Nelineární charakter reakce neumožňuje použít měření reakční rychlosti mezi těmito fotometrickými body. 

• měření rychlosti reakce se používá u kinetických metod, nejčastěji při stanovení katalytické aktivity enzymů ,viz dále. Rychlost se počítá z více fotometrických měření a vyhodnocuje se i linearita průběhu reakce. 

Stanovení enzymové aktivity.

Enzym má velkou substrátovou specifičnost a značnou katalytickou účinnost. Pro správnost měření:

a)   musíme mít substrát, který je rozkládán pouze stanovovaným enzymem 

b)    v reakční kyvetě musí být vhodná koncentrace substrátu, aby nedocházelo v měřeném intervalu k ovlivnění rychlosti reakce jeho koncentrací

c)   ke stanovení substrátu (jeho úbytku) nebo produktů enzymatické reakce musíme mít vhodnou metodu (využití měření při 340 nm pro změny v koncentraci NADH) 

Reakce musí probíhat konstantní rychlostí tzn. úbytek substrátu nebo přírůstek produktu v čase musí být lineární, nezávislý na koncentraci reagujících látek.

Enzymovou aktivitu (katalytickou koncentraci vyjadřujeme v katalech).

1 katal odpovídá takové katalytické koncentraci enzymu, která katalyzuje za optimálních podmínek přeměnu 1 molu substrátu za 1 sekundu. Pro biochemické vyjádření aktivity je tato jednotka příliš velká, a proto se používá μkatal nebo nkatal. V zahraniční literatuře se stále můžeme setkat s mezinárodní jednotkou U. Definice je obdobná jako u jednotky katal, ale jde o přeměnu 1 μmolu za jednu minutu.  1μkatal = 60 U ; 1 U = 16,66 nkatal

Obr. 13   Příklad kinetického stanovení AST (hodnota 5,45 μkat/l), AU 2700, dvoučinidlová metoda (R1,R2), měření primární 340 nm a sekundární vlnové délky 660 nm (absorbance sekundární vlnové délky je pro náš případ tak nízká, že absorbance primární vlnové délky se prakticky nemění, resp. se nepatrně sníží stejně pro všechny měřené fotometrické body), pro výpočet rychlosti úbytku substrátu se využívá měření ve 13. a 20. fotometrickém bodě, v tomto rozmezí se sleduje linearita reakce a z rozdílu absorbancí, které jsou označeny černou šipkou, je možné vypočítat úbytek absorbance za 1 minutu (pro toto stanovení je 0,1267).

Faktor se stanoví při kalibraci použitím kalibrátoru s deklarovanou hodnotou aktivity AST, která je dělená změnou absorbance za 1 minutu. 

Pro AST se sleduje úbytek NADH ⇒ NAH⁺ (porovnej s grafy spekter obr.5, 6)