Články a aktuality 2012 - 2018

Monoklonální gamapatie (MG) tvoří heterogenní skupinu onemocnění, která jsou charakteristická přítomností monoklonálního Ig proteinu (MIG) produkovaného klonálními plazmocyty (PC), jakožto terminálními stádii transformovaných B lymfocytů.

Průtoková cytometrie (flow cytometry, FC) prozatím nepatří u MG mezi diagnostické metody, její význam však stále roste a na vybraných pracovištích je již zařazena mezi standardní analýzy prováděné u MG. Hlavní výhodou FC je poměrně jednoznačné určení typu PC (normální vs. klonální), dále její senzitivita a zejména prognostický význam (Paiva et al., 2009). FC se stala nezbytnou nejen v době stanovení diagnózy MG (zejména u nejasných případů), ale také při studiu léčebné odpovědi (Paiva et. al, 2010; Kovářová et al., 2011a).

Všechny PC exprimují znaky CD38 a CD138, a tedy pro ujasnění typu PC je nezbytné provést analýzu dalších znaků, aby mohly být odlišeny normální PC (CD19⁺CD56^-) od aberantních PC (CD19^-CD56⁺ příp. CD19^-CD56^- či CD19⁺CD56⁺). S rozvojem průtokové cytometrie se ukazuje, že pouhá 4-barevná analýza (zahrnující kombinaci znaků CD38, CD138, CD19, CD56) v některých případech nemá dostatečnou výpovědní hodnotu, jelikož existují také normální CD19^-CD56^- PC nebo CD19^-CD56⁺ PC, přičemž důvod ztráty CD19 či nabytí CD56 není znám. Proto je nyní snaha stanovit klonalitu PC pomocí tzv. polychromatické FC - kombinující povrchové (CD38, CD138, CD19, CD56 a případně také CD45 a CD27) a intracelulární znaky (lehké imunoglobulinové řetězce - kappa a lambda) - pro jednoznačnou identifikaci a enumeraci klonálních PC (Perfetto at al., 2004; Kovarova et al., 2011b).

U nových a zejména nejasných případů je důležité ověřit přítomnost a zastoupení klonálních PC, neboť jedině tak lze odlišit MG od reaktivních stavů či od jiných plazmocelulárních onemocnění (Waldeströmova makroglobulinémie, primární amyloidóza aj.). Mezi nejčastější MG patří monoklonální gamapatie nejasného významu (MGUS), která je řazena mezi benigní onemocnění, avšak s možností progrese do maligního mnohočetného myelomu (MM) či jiné lymfoproliferace (Kyle et al., 2010). Pro MGUS je charakteristická přítomnost obou typů PC, přičemž hraniční hodnotou je nález ≥95% patologických PC abnormálního fenotypu, což již vypovídá o transformaci do MM (Pérez-Persona et al., 2007). Prozatím není známo, zdali stanovení počtu nejen abnormálních, ale rovnou klonálních PC, může napomoci lépe identifikovat osoby s MGUS s vysokým rizikem transformace nebo naopak určit tzv. benigní MGUS subjekty, u kterých je riziko transformace velmi nízké.

Jako velmi důležité se u MM ukazuje monitorování minimální reziduální nemoci (minimal residual disease, MRD) po prodělané léčbě (nejčastěji po autologní transplantaci kmenových buněk). S nástupem účinnějších léčiv a léčebných postupů je častěji dosahováno přísné kompletní remise (stringent complete remisson, sCR) splňující následující kritéria: negativní imunofixace v séru i moči, nepřítomnost měkotkáňového plazmocytomu, <5% PC v kostní dřeni (dle morfologického nálezu), absence klonálních PC zjištěná imunohistochemicky či ≥4-barevnou FC a normální poměr sérových lehkých volných řetězců (serum free light chains, FLC) (Rajkumar et al., 2011). Vývoj detekčních metod pak změnil definici negativní MRD, přičemž byl zaveden pojem „imunofenotypová remise“ (immunophenotypic remission, iCR) nebo „imunofenotypová odpověď“ (immunophenotypic response, IR), a tedy stanovení nepřítomnosti klonu plazmocytů pomocí FC (Rajkumar et al., 2011; Paiva et al., 2011; Hájek et al., 2012). Výše uvedená nejednoznačnost 4-barevných analýz a technologický pokrok v oblasti průtokové cytometrie však znamenají, že pro optimální hodnocení MRD a stanovení iCR se již nelze obejít bez analýzy klonality zmiňovanou polychromatickou FC (Kovarova et al., 2011b ; Hájek et al., 2012).

V Laboratoři průtokové cytometrie při Oddělení klinické hematologie FN Brno byla 8-barevná analýza klonality s využitím výše uvedených znaků (CD38/CD45/ck/cl/CD138/CD19/CD56/CD27) zavedena počátkem roku 2011. Analýzy jsou prováděny v plné kostní dřeni (KD) jednak u pacientů s podezřením na MG, ale také v rámci monitorování vývoje onemocnění u neléčných MGUS či pacientů s MM po prodělané léčbě či v době návratu onemocnění. Množství použitého biologického materiálu je vždy optimalizováno tak, aby z analýzy bylo možno získat minimálně 500 PC (optimálně 1000 a více PC), čímž je zachována dostatečná citlivost a výpovědní hodnota analýzy.

Bylo zjištěno, že u téměř všech analyzovaných osob lze detekovat CD38⁺CD138⁺ PC, výjimku tvoří pouze vzorky KD silně naředěné periferní krví (špatný odběr). Co se týče zastoupení jednotlivých subpopulací, bylo potvrzeno, že dle znaků CD19 a CD56 lze PC zjednodušeně rozdělit na normální a abnormální PC. Jak však bylo ověřeno cytoplazmatickou analýzou imunoglobulinových lehkých řetězců kappa a lambda v jednotlivých subpopulacích dle CD19/CD56, toto rozdělení je pouze orientační a nemusí jednoznačně odpovídat polyklonálním a klonálním PC. Zejména u osob s MGUS či u MM v období po proběhlé léčbě tak byla potvrzena nezbytnost stanovení klonality PC, jelikož počet abnormálních PC neodpovídá skutečnému počtu klonálních PC a výsledky tak mohou vést ke špatné klinické interpretaci. V některých případech však byla klonální populace odhalena až prostřednictvím dalšího znaku, kdy teprve chybění CD27 na patologických PC napomohlo spolehlivé identifikaci malého klonu PC na pozadí početně převažujících polyklonálních PC (viz obrázek).

Obrázek: Multiparametrická analýza fenotypu a klonality PC. V době stanovení diagnózy je u pacienta (A1-A3) nalézána naprostá převaha klonálních PC (99,7% aPC - fialová populace) jednoznačného fenotypu CD56⁺ckappa⁺CD27^-, což potvrzuje dg. MM. Naopak ve 3. měsíci po transplantaci (B1-B3) nelze dle CD19/CD56 jednoznačně stanovit zastoupení normálních a klonálních PC, resp. by při hodnocení dle přítomnosti CD19 došlo k podhodnocení počtu normálních PC (nPC - modrá populace). Malý klon PC (9,4% aPC - fialová populace) je nalezen až v rámci populace CD19^-CD56⁺ PC na základě nepřítomnosti znaku CD27. Analýza proběhla na přístroji BD FACSCanto II (BD Biosciences), reanalýza byla provedena pomocí SW Infinicyt (Cytognos), uvedeny jsou relativní i absolutní počty PC.

Závěrem lze konstatovat, že polychromatická analýza klonality PC pomocí průtokové cytometrie přináší dostatek informací k potvrzení normality PC a může vést k odhalení i velmi malého klonu PC. Při analýze dostatečného množství PC je pak senzitivita tohoto přístupu až 10^-4 a blíží se citlivosti přístupů na DNA úrovni. Klinický význam průtokové cytometrie je tedy nesporný. Jedná se o diagnosticky užitečný nástroj, který kvantifikací podílu normálních a klonálních PC napomáhá odlišení jednotlivých MG a stanovení stupně MRD.

Použitá literatura:

1. Paiva B, Vidriales MB, Pérez JJ et al. Multiparameter flow cytometry quantification of bone marrow plasma cells at diagnosis provides more prognostic information than morphological assessment in myeloma patients. Haematologica. 2009;94(11):1599-1602

2. Paiva B, Almeida J, Pérez-Andrés M et al. Utility of flow cytometry immunophenotyping in multiple myeloma and other clonal plasma cell-related disorders. Cytometry B Clin Cytom 2010;78(4):239-252 Kovářová L, Hájek R. Prognostický význam imunofenotypizace u nemocných s monoklonální gamapatií nejasného významu a mnohočetným myelomem. Klin Biochem Metab.2011a;19(40)2:96-100 Perfetto SP, Chattopadhyay PK, Roederer M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 2004;4(8):648-655 Kovarova L, Varmuzova T, Zarbochova P et al. Flow cytometry in monoclonal gammopathies. Klin Onkol. 2011b;24 Suppl:S24-29 Kyle RA, Durie BG, Rajkumar SV et al. Monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) and smoldering (asymptomatic) multiple myeloma: IMWG consensus perspectives risk factors for progression and guidelines for monitoring and management. Leukemia. 2010;24(6):1121-1127 Pérez-Persona E, Vidriales MB, Mateo G. et al. New criteria to identify risk of progression in monoclonal gammopathy of uncertain significance and smoldering multiple myeloma based on multiparameter flow cytometry analysis of bone marrow plasma cells. Blood. 2007;110(7):2586-2592 Rajkumar SV, Harousseau JL, Durie B et al. Consensus recommendations for the uniform reporting of clinical trials: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 1. Blood 2011;117(18): 4691-4695 Paiva B, Martinez-Lopez J, Vidriales MB et al. Comparison of immunofixation, serum free light chain, and immunophenotyping for response evaluation and prognostication in multiple myeloma. J Clin Oncol. 2011;29(12):1627-1633 Hajek et al. Diagnostika a léčba mnohočetného myelomu. Transfuze a hematologie dnes. 2012;Suppl1