Články a aktuality 2012 - 2018

DNA diagnostika je relativně mladou částí vědy, která nám pomáhá například při stanovení diagnózy dědičných onemocnění, nebo nám naopak může pomoci rozpoznat přenašeče těchto chorob, kteří jsou jinak fenotypově zcela zdraví. V prezentaci se seznámíte se základními principy DNA diagnostiky a jejího využití v praxi. Na čtyřech kazuistikách autorka demonstruje příklady onemocnění, u kterých je vyšetření DNA stěžejní částí stanovení diagnózy. Jde například o Marfanův syndrom, Fanconiho anémii, nebo Thanatoforickou dysplázii. V neposlední řadě se DNA diagnostiky využívá při soudním šetření, například za účelem určení otcovství.

 Kontrastem indukovaná nefropatie (CIN) a později používané kontrastem indukované akutní poškození ledvin (CI-AKI) je diagnóza známá již od 60. let minulého století. Běžně se považuje za 3. nejčastější příčinu poškození ledvin u hospitalizovaných nemocných. Je definována jako vzestup s-krea o 50% či o 44 umol/l, a to po 48-72 hod po podání kontrastní látky. V poslední době se však náš pohled na toto postižení mění, zejména v souvislosti s její relativně snižující se incidencí a pochopením různých úskalí, kterými jsou výsledky dosavadních studií a analýz zatíženy. Přednáška má za cíl shrnout dosavadní poznatky, popsat chybějící informace a pokusit se nabídnout nefroprotektivní opatření, která se ve světle dnešních poznatků zdají být nejúčelnější.

Detekce přítomnosti nádorových buněk v lymfatických uzlinách u nemocných s primárními či sekundárními nádory plic je v současné době limitována možnostmi standardních histopatologických metod. Průběh nádorového onemocnění u některých pacientů nasvědčuje tomu, že mikrometastázy nemusí být při běžném histologickém vyšetření odhaleny a podhodnocení pTNM stagingu nemoci vede k ne zcela přesnému podání adjuvantní onkologické léčby.

Cílem studie bylo porovnání výsledného zařazení pacientů do TNM klasifikace při použití různých metod detekce (H&E, IHC CK19, OSNA) nádorových buněk v hilových a mediastinálních lymfatických uzlinách primárních (nemalobuněčných) a sekundárních (metastázy kolorektálního karcinomu a karcinomu prsu) nádorů plic.

Vyšetřovanou skupinou jsou pacienti podstupující radikální chirurgickou léčbu pro nemalobuněčný primární plicní karcinom. Bylo vyšetřeno 64 pacientů, u každého, pokud to bylo možné, bylo stanovení provedeno v 5 skupinách lymfatických uzlin. Celkem bylo vyšetřeno 286 skupin uzlin, zahrnujících celkem 885 jednotlivých uzlin, v průměru 13,8 na pacienta.

Shodné výsledky vyšetření metodami H&E, IHC a OSNA byly zaznamenány u 263 skupin lymfatických uzlin (82,2 %). Pozitivní průkaz nádorových buněk metodou OSNA při negativitě H&E vyšetření byl zaznamenán u 27 skupin uzlin (8,4 %). V 8 případech (2,5 %) byla pozitivní metoda H&E, zatímco výsledek získaný metodou OSNA byl negativní. Výsledky vyšetření IHC CK19 až na dvě skupiny uzlin odpovídaly vyšetření H&E.

 Zatímco výsledky vyšetření lymfatických uzlin metodou IHC CK19 nevedly k téměř žádné změně v zařazení do pTNM klasifikace v porovnání s vyšetřením H&E, vyšetření metodou OSNA vedlo k zařazení 14 (21,9%) pacientů do vyšší kategorie pTNM a 3 (4,7%) pacientů do nižší kategorie pTNM. Klinický význam zůstává předmětem navazujícího výzkumu.

Tato prezentace byla podpořena projektem Molekulární genetika nádorových a kardiovaskulárních chorob (CZ.1.07/2.3.00/20.0040)

Vitamin D je neaktivním prekursorem biologicky účinného 1 a,25–dihydroxyvitaminu D (1 a,25(OH)2D), který spolu s parathormonem a kalcitoninem řídí homeostázu vápníku. Rozeznáváme 2 formy vitaminu D, tj. cholekalciferol (vitamin D3) a ergokalciferol (vitamin D2). Hlavním zdrojem vitaminu D3 je jeho endogenní biosyntéza z prekursoru 7-dehydrocholestrolu, u kterého je fotolyticky po exposici plasmatické membrány keranocytů v kůži slunečním světlem o vlnových délkách 280-320 nm otevřen kruh B. Z tohoto provitaminu D3 vzniká spontánní isomerizací cholekalciferol. Prekursorem vitaminu D2, který si neumí lidský organismus sám syntetizovat, je ergosterol, který je obsažen například v houbách. Biosyntéza ergokalciferolu potom probíhá identicky jako u vitaminu D3.  Z hlediska biologické funkce je otázkou, zda je vitamin D2 rovnocenný s vitaminem D3. Oba druhy vitaminu D, tj. D2 a D3, se od sebe liší v postranním řetězci molekuly na 17 b-pozici sekosteroidu (vitamin D2 má jednu dvojnou vazbu a jednu methylovou skupinu navíc), jejich další metabolická cesta je ale stejná, tj. pomocí hydroxyláz patřících do rodiny cytochrom-P450 enzymů nejprve probíhá hydroxylace vitaminu D v poloze C25 prostřednictvím v játrech produkované 25-hydroxylázy za vzniku kalcidiolu, tj. 25-hydroxyvitaminu D (25(OH)D), který odráží míru zásobení organismu vitaminem D z exogenních i endogenních zdrojů. Biologicky aktivní, hormonálně účinný kalcitriol (1 a,25-dihydroxyvitamin D, 1 a,25(OH)2D) vzniká v ledvinách účinkem 1 a-hydroxylázy, která je hormonálně regulovaná (PTH ji stimuluje, naopak 1 a,25(OH)2D inhibuje). V ledvinách, ale i v dalších tkáních, se vyskytuje enzym 24-hydroxylasa, která katalyzuje syntézu 24,25(OH)2D z 25(OH)D, především však inaktivuje 1 a,25(OH)2D jeho přeměnou na biologicky neúčinný 1 a,24,25(OH)3D. 1 a,25(OH)2D  se podílí na vlastní inaktivaci tím, že stimuluje expresi 24-hydroxylázy. C3-epiméry vitaminu D lišící se konfigurací hydroxylu na C3 mají v porovnání s nativními metabolity jen přibližně 20% biologickou aktivitu, ale jsou charakteristické pro první rok života, kdy je u novorozenců v cirkulaci nacházeno více než 50 % kalcidiolu ve formě C3-epiméru.

1 a,25(OH)2D  realizuje svoji biologickou funkci interakcí s jaderným receptorem specifickým pro vitamin D (VDR), ale i negenomicky interakcí s membránovými receptory cílových buněk. Ledviny jsou téměř výlučným zdrojem cirkulujícího 1 a,25(OH)2D, ale i řada dalších buněk a tkání exprimuje 1 a-hydroxylázu a mohou tak lokálně auto- či parakrinním mechanismem vytvářet 1 a,25(OH)2D. Vitamin D je klíčovým regulátorem homeostázy kalcia a fosforu ve smyslu absorpce střevního kalcia a fosfátů, reabsorbce Ca a P v ledvinách a mobilizace Ca, P z kosti, ale má také významné extraskeletární biologické účinky, kdy působí v organismu antiproliferativně, prodiferenciačně, proapopticky a imunomodulačně (suprimuje humorální odezvu, aktivuje vrozenou celulární odezvy). Dlouhodobý nedostatek vitaminu D, a z něho vyplývající snížení hladiny 1 a,25(OH)2D způsobuje křivici u dětí a osteomalácii u dospělých. Spolu s nedostatkem kalcia a dalšími změnami souvisejícími se vzrůstajícím věkem se podílí i na osteoporóze, alopecii, slábnutí svalů, vývoji sekundárního hyperparathyroidismu u pacientů s chronickou renální nedostatečností, a současný výzkum naznačuje i jeho spojení se zvýšeným krevním tlakem, s depresí, s poruchami imunitního systému vedoucími k mnohočetné sklerose, k revmatické artritidě a k diabetu. V současné době roste počet studií, ze kterých vyplývá vztah mezi prevalencí výskytu rakoviny především tlustého střeva, prostaty a prsu, ale i řady dalších maligních onemocnění, a mírou zásobení organismu vitaminem D. Dostupnost 25(OH)D pro lokální biosyntézu 1 a,25(OH)2D v extrarenálních buňkách je významná v prevenci maligních onemocnění.

Z výše uvedeného je patrné, že správné stanovení vitaminu D a jeho metabolitů z hlediska přesnosti, ale především pravdivosti, je velkou výzvou do budoucnosti a vývoj technik, které toto správné stanovení umožní, bude odrážet potřeby, které neustále vzrůstají vzhledem k významu vitaminu D a jeho metabolitů. Výhodou imunoanalytických postupů je velká kapacita stanovení a analytická citlivost v řádu pg/zkumavku. Imunoanalytické stanovení je ale také zatíženo řadou problémů, přičemž největším je specificita použité protilátky, která může zkříženě interagovat jak s metabolity vitaminu D3, tak i s metabolity vitaminu D2. Poměrně vysoké zkřížené reakce mají protilátky některých výrobců vůči 24,25(OH)2D, přičemž v cirkulaci je tento metabolit v nanomolovém množství. Zásadní je rovněž problém se specificitou protilátky při stanovení 1 a,25(OH)2D, jehož koncentrace je přibližně o 3 řády nižší než koncentrace 25(OH)D. Velmi málo je diskutována specificita používaných protilátek vůči konjugátům (sulfát, glukuronid) hydroxylovaných metabolitů vitaminu D, přičemž v cirkulaci může být i stejné množství např. 25(OH)D3 a 25(OH)D3-3-sulfátu. Dalším problémem může být silná vazba metabolitů vitaminu D na vitamin D vazebný protein (VDBP).  Problémem je tedy standardizace použitých imunoanalytických kitů, kdy různé typy esejí dávají různé výsledky, na jejichž základě jsou odvozovány i různá referenční rozmezí a přijímají se klinická rozhodnutí, která nemusí odrážet skutečný stav zásobení populace vitaminem D.

Chromatografické postupy mají velkou výhodu ve skutečnosti, že umožňují separaci jednotlivých odlišně hydroxylovaných a jinak derivatizovaných (různé typy konjugátů, např. sulfáty a glukuronidy) metabolitů vitaminu D včetně rozlišení metabolitů cholekaciferolu od metabolitů ergokalciferolu nebo C3-epimérů vitaminu D. Nevýhodou mohou být v oblasti rutinních analýz relativně složité přípravy vzorků před vlastní chromatografickou analýzou, metody jsou limitovány kapacitně, a většinou je citlivost spektrofotometrické detekce pro stanovení kalcitriolu nedostatečná.

Obecně výhodné z hlediska universálnosti, citlivosti detekce, specificity i z časového hlediska jsou postupy založené na kombinaci vysokoúčinného kapalinového chromatografu (HPLC) pracujícího v režimu reversní fáze (RP-HPLC) s detekcí analytu provedenou na hmotovém detektoru (MS), který většinou pracuje v tandemovém zapojení (MS/MS). Je zde dvojí separační princip, tj. chromatografický a hmotově-spektrometrický založený na poměru hmoty iontu k jeho náboji. Jednoznačnost stanovení jednotlivých metabolitů ve spektru řady dalších metabolitů vitaminu D, použití isotopicky značených standardů eliminujících vliv biologické matrice při kvantifikaci, a další vývoj spojený s automatizací vede k závěru, že imunoanalytické postupy stanovení metabolitů vitaminu D jsou nebo v blízké budoucnosti budou technikou MS překonány, a již nyní jsou postupy HPLC-MS/MS užívány jako vhodná referenční metoda stanovení metabolitů vitaminu D. Limitujícím faktorem je vysoká pořizovací cena přístroje, který zatím není běžnou součástí klinicko-biochemické laboratoře.

Tato prezentace byla podpořena projektem Molekulární genetika nádorových a kardiovaskulárních chorob (CZ.1.07/2.3.00/20.0040)

Cílem prezentace je představit zahajovanou studii sledování vitamínu D u těhotných a v pupečníkové krvi novorozenců. Předpokládáme vyšetření cca 1000 probandů. Hladiny vit. D budou korelovány s hladinou sérových minerálů P a Ca, s hladinou PTH a hladinou FGF23. Na základě této pilotní studie předpokládáme návrh provedení multicentrické studie v ČR, jejímž cílem bude optimalizace suplementace vit. D v průběhu těhotenství.

Tato prezentace byla podpořena projektem Molekulární genetika nádorových a kardiovaskulárních chorob (CZ.1.07/2.3.00/20.0040)

Jde o dynamický zátěžový test, který slouží především k definování limitů a rezervy kardiovaskulárního a respiračního aparátu. Tradičně pacienta vystavujeme zátěži bicyklového ergometru, kontinuálně měříme průtok vzduchu a analyzujeme složení dýchacích plynů. Pomocí této metody komplexně posuzujeme možnosti pacienta na úrovni ventilace (obstrukční a restrikční poruchy), tak na úrovni krevního oběhu (ICHS, TEN, plicní hypertenze, limitace obezity apod.). Metoda je součástí jak předoperačního vyšetření u kardiochirurgických operací či plicních resekcí, tak následného hodnocení efektu výkonu. Dále ji využijeme např v diferenciální diagnostice námahové dušnosti. Přednáška dále přibližuje průběh i možné komplikace vyšetření.

Cílem prezentace je poukázat na méně známý fakt o vztahu mezi aldosteronem, parathormonem a osteoporózou. Obsahem je patofyziologie systému Aldosteron-renin, vztah k regulaci kalcémie a hladin parathormonu a to vše je demonstrováno na příkladu jedné kazuistiky.

Přednáška podává souhrnný pohled na šokové stavy se zaměřením na jejich patofyziologii, klinický obraz, diagnostiku a terapii v dětském věku. V úvodu přednášky je popsán klasický pohled na patofyziologii šokových stavů se zaměřením na oběhové změny. Dále jsou popsány kompenzační mechanismy, kterými se dětský organismus přizpůsobuje rozvoji šokového stavu s popisem rozdílů v adaptaci dětského a dospělého pacienta. Následuje část týkající se klinických příznaků, které typicky provází šokové stavy u dětí se specifickým zaměřením na hypovolemický šok, který je v dětském věku nejčastěji zastoupen. Druhá polovina přednášky přibližuje takzvanou metabolickou teorii, která se uplatňuje v teorii šokových stavů v posledních letech. Konec přednášky podává stručný přehled základních léčebných principů šokových stavů.

Účelnou péči v tomto kontextu rozumíme zajištění co nejnižší morbidity a mortality při současném zachování co nejvyšší kvality života, to vše za přijatelných nákladů plátce péče.

Závažnou a specifickou charakteristikou péče o nemocné s chronickým onemocněním ledvin (CKD) v České republice je skutečnost, že 40-50% z nich není podchyceno pro nefrologickou péči až do pozdních stádií a tito pacienti pak přicházejí k dialýze tzv „z ulice“, aniž by byli známi nefrologickému / dialyzačnímu pracovišti více než 3 měsíce před zahájením dialýzy. Tento stav se zatím nedařilo změnit. V současné době vstupuje v platnost nový Věstník Ministerstva zdravotnictví týkající se náplní preventivních prohlídek. Nemocní starší 50 let s hypertenzí, diabetem či kardiovaskulárním onemocněním budou muset mít v rámci preventivní prohlídky 1x za 4 roky vyšetřenou sérovou koncentraci kreatininu a z toho odhadnutou velikost glomerulární filtrace. Pacienti s glomerulární filtrací nižší než 0,5 ml/s a dále pacienti s proteinurií nad 1 g/24 h, glomerulární hematurií, genetickými a vzácnými chorobami ledvin budou následně odesíláni k nefrologickému vyšetření.

Přednáška navazuje na přednášku z roku 2015 a shrnuje základní principy regulace kalcio-fosfátového metabolismu. Je zaměřena na význam fibroblast growth faktoru 23 a jeho ko-faktoru alfa-klotho jako hlavního systému regulace fosfatémie, informuje o principech stanovení FGF23 a problematice stanovení jeho intaktního a celkového FGF23. Jsou zmíněny i poruchy spojené s FGF23 a především u Chronic kidney disease – metabolic bone disease (CKD-MBD). Závěrem shrnuje potencionální indikace FGF23 a alfa-klotho v klinické praxi.