Základní principy analytických metod

3.1. Potenciometrie

Na odděleních klinické biochemie se metody založené na potenciometrickém principu měření využívají velice často. Stačí připomenout metody na všech analyzátorech acidobazické rovnováhy a měření pomocí iontově selektivních elektrod (ISE) na velkých rutinních analyzátorech. Potenciometrie je elektrochemická metoda založená na měření rovnovážného napětí článků. Článek se skládá ze dvou elektrod, měrné a referentní. Elektroda je heterogenní elektrochemický systém tvořený alespoň dvěma fázemi. Pevná fáze vede elektrický proud prostřednictvím elektronů, kapalná fáze elektrolyt  vede elektrický proud ionty. Elektrodový děj je oxidačně-redukční reakce umožňující přenos náboje mezi fázemi elektrody. Na základě dohody zapisujeme elektrodový děj chemickou rovnicí ve směru redukce: 

oxidovaná forma + n elektronů  ⇆ redukovaná forma 

Elektrody můžeme dělit podle jejich složení nebo podle použití.

    Podle složení:

• Kovové elektrody ponořené do roztoku, který obsahuje kation stejného kovu. Například stříbrná elektroda ponořená do roztoku obsahující Ag+, obdobně zinková elektroda v roztoku Zn2+ a pod. Do této skupiny patří i vodíková elektroda. Je to kationtová plynová elektroda složená z platinové elektrody pokryté platinovou černí sycené plynným vodíkem. V případě, že je tlak vodíku roven normálnímu tlaku 101 325 Pa a aktivita vodíkového kationtu je rovna jedné, mluvíme o standardní vodíkové elektrodě (SHE). Potenciál této elektrody byl konvenčně určen nulový a elektrodový potenciál libovolné elektrody je definován jako rovnovážné napětí článku tvořeného měrnou elektrodou jako katodou a standardní vodíkovou elektrodou jako anodou.
• Jiný druh elektrod tvoří kov pokrytý vrstvičkou své málo rozpustné soli ponořený v roztoku aniontů této soli. Do této skupiny patří důležitá argentochloridová elektroda (stříbrná el. pokrytá AgCl ponořená do KCl) a kalomelová (rtuť, kalomel Hg₂Cl₂ v KCl.
• Redoxní elektrody jsou tvořeny plíškem ušlechtilého kovu (platina,zlato) ponořeného do roztoku obsahujícího oxidovanou a redukovanou formu systému (Např. Fe²⁺/Fe³⁺)
• Membránové elektrody jsou iontově selektivní elektrody (ISE) využívající vzniku membránového potenciálu na membráně , která je nestejně propustná pro různé ionty.

Podle použití:

• Elektroda měrná (indikační, pracovní) je elektroda jejíž potenciál je závislý na koncentraci měřené látky v analyzovaném vzorku. Nejčastěji je to kovová, redoxní nebo membránová  elektroda.
• Elektroda referenční - její potenciál nezávisí na složení analyzovaného vzorku, 

                       nemění se ani procházejícím proudem, argentochloridová,kalomelová 

Příklady některých elektrod:

Skleněná elektroda

Skleněná elektroda  je nejznámější a nejdéle používanou membránovou elektrodou, která se používá jako měrná elektroda na měření pH. Skleněnou  elektrodu tvoří banička ze speciálního elektrodového skla. Na obou površích vně i uvnitř se vytváří vrstvička hydratované kyseliny křemičité, banička je naplněna pufrem o stálém pH a koncentraci chloridových iontů, do kterého je ponořena argentochloridová elektroda. Mezi pufrem uvnitř, vzorkem vně a hydratovaným povrchem skleněné baničky dochází k výměnné reakci za vzniku membránového potenciálu, který je uvnitř konstantní a vně závisí na koncentraci vodíkových iontů v měřeném vzorku (pH).   Vrstvička křemičitého hydrogelu na povrchu je polopropustná pro H⁺ ionty a chová se jako iontoměnič (výměna H⁺ z roztoku za Na⁺ ze skla). Skleněná elektroda musí být ponořena ve vodném roztoku, membrána musí být hydratována.  Potenciál skleněné elektrody se liší podle konstrukce a mění se stářím elektrody. Chyby v měření pH nastávají u extrémně vysokých a nízkých hodnot pH. Pro rozmezí pH 2 -12 je naměřený potenciál v lineárním vztahu k hodnotě pH. Provádí se dvoubodová kalibrace. Teoreticky přírůstek pH o jednu jednotku znamená pokles potenciálu o 0,059 V. 

Obr. 17 Závislost potenciálu skleněné elektrody na pH měřeného roztoku. Zelenou šipkou je 

       označena linéární závislost vhodná k měření. Při nízkém a vysokém pH roztoku vykazuje  

       elektroda chyby. Rozsah linearity závisí na konstrukci elektrody.

Skleněná elektroda se pro měření pH  používá v kombinaci s referenční nejčastěji argentochloridovou nebo kalomelovou elektrodou. Často bývá referenční elektroda zabudovaná v jednom tělese spolu se skleněnou elektrodou.  Skleněná elektroda je ve všech analyzátorech acidobazické rovnováhy. Speciální skleněnou elektrodu lze také použít jako sodíkovou iontově selektivní elektrodu (viz dále)

Obr. 18 Nahoře kombinovaná skleněná elektroda s argentochloridovou referenční elektrodou, dole 

       schema pH elektrody acidobazického analyzátoru

Severinghansova elektroda

Používá v acidobazických analyzátorech na přímé měření CO₂. Jedná se o skleněnou elektrodu, která je od vnějšího prostředí oddělena membránou propouštějící CO₂. V prostoru mezi membránou a skleněnou elektrodou dochází k následující reakci:

CO₂    +   H₂O        ↔    H⁺        + HCO₃^-

Aktivita protonu H⁺ v tomto prostoru je přímo úměrná parciálnímu tlaku CO₂ ve zkoumaném vzorku a je měřena vlastní skleněnou elektrodou. 

Obr.19   Severinghansova elektroda, mebrána propuští oxid uhličitý, který mění koncentraci   

        H⁺  v roztoku. Aktivita protonu H⁺ v tomto prostoru je přímo úměrná parciálnímu tlaku CO₂

        ve zkoumaném vzorku a je měřena vlastní skleněnou elektrodou. 

Obr. 20  Měření pH krve acidobazickým analyzátorem skleněnou elektrodou s referenční 

       argentochloridovou elektrodou. Stejná referenční elektroda slouží i na měření pCO₂ 

       Severinghansovou  elektrodou a ostatních iontů ISE (Na, K, Cl, Ca) 

Iontově – selektivní elektrody (ISE)

Jsou určeny k měření aktivit různých iontů a využívají vzniku membránového potenciálu na různých membránách. Podstata je obdobná jako u měření pH membránovou skleněnou elektrodou. Potenciál na vnější straně membrány závisí na koncentraci příslušného měřeného iontu, potenciál vnitřní membrány je konstantní. V elektrolytu je vnitřní  referenční elektroda. Iontově selektivní membrány jsou odděleny od biologických vzorků pro měříní iontů propustnou membránou zadržující proteiny. Přímou potenciometrií se v acidobazických analyzátorech měří Na⁺, K⁺ Cl ^-,ionizovaný vápník. Obdobně jsou konstruovány ISE u automatických analyzátorů, kde se před měřením provádí ředění vzorku.