Zpracování a využití biologického materiálu pro výzkumné účely od nemocných s monoklonální gamapatií - Ing. Martina Almáši, Ph.D.

LEHABI - Laboratoř experimentální hematologie a buněčné imunoterapie byla založena na Oddělení klinické hematologie (OKH) FN Brno. Laboratoř se už více jak deset let zabývá vstupním zpracováním a archivací biologického materiálu pro výzkumné projekty  z oblasti hematologie, zvláště z oblasti monoklonálních gamapatií. Postupně byla založena banka biologických vzorků, která je neustále doplňována o archivaci nových vzorků pro následné výzkumné analýzy. Jedná se o vzorky získané z Interní hematologické a onkologické kliniky FN Brno (IHOK), v rámci výzkumných projektů jsou k nám také transportovány vzorky z center České myelomové skupiny (CMG). Činnost LEHABI je úzce spojena s laboratoří průtokové cytometrie (obě pracoviště součástí OKH FN Brno), dále s výzkumnými aktivitami Babákovy myelomové skupiny při Ústavu patologické fyziologie Lékařské fakulty Masarykovy univerzity a s Laboratoří molekulární cytogenetiky Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity v Brně.

Pro relevantní statistické analýzy obecně je problémem dosažení kritického množství vzorků pro výzkumné projekty. Archivujeme biologický materiál především od pacientů s mnohočetným myelomem (MM) a monoklonální gamapatií nejasného významu (MGUS), ale i s raritními hematologickými onemocněními. Archivace důležitých biologických materiálů je považována za vstupní kritickou část výzkumné činnosti hrající klíčovou roli při testování výzkumných hypotéz.

Laboratorní analýzy monoklonálních gamapatií jsou založeny na separaci plazmatických buněk (PB) z kostní dřeně (KD) nemocných. Patologické populace  jsou heterogenní a mohou obsahovat méně zralé formy B lymfocytů (Kovářová, 2009).  Dochází k postupné akumulaci jediného klonu terminálních B-lymfocytů, jejichž produktem je patologický monoklonální imunoglobulin zodpovědný za příznaky nemoci. Obecným problémem pro výzkumné analýzy u monoklonálních gamapatií je častý nedostatek nádorové frakce buněk, což je dáno umístněním nádorových buněk v kostní dřeni v kombinaci s nízkou infiltrací.

Kovarova L, Buresova I, Buchler T, et al. Phenotype of plasma cells in multiple myeloma and monoclonal gammopathy of undetermined significance. Neoplasma. 2009;56(6):526-32. 

Biologickým materiálem, který se pro výzkumné účely zpracovává je zejména kostní dřeň a periferní krev. Tento odběr je prováděn v rámci rutinních odběrů. Kostní dřeň slouží jednak pro rutinní flowcytometrické vyšetření, jednak pro zpracování na plazmu a k separaci plazmatických buněk. Odběry periferní krve slouží rovněž pro rutinní flowcytometrické vyšetření k izolaci DNA a pro zpracování na plazmu a sérum.

Pro selekci plazmatických buněk (PB) je kostní dřeň (10-40 ml) odebrána do heparinu a ihned smíchána s transportním médiem v poměru 1:1 obsahujícím IMDM médium (Iscove´s Modified Dulbeccoś Medium, Sigma-Aldrich). Ze vzorku kostní dřeně určeného k selekci plazmatických buněk se nejprve oddělují mononukleární buňky denzitní gradientovou centrifugací na Ficoll-Plaque Plus (Scintila). Obrázek znázorňuje navrstvení prstence mononukleárních buněk na denzitní gradientové médium Ficoll, pod tímto médiem zůstanou červené krvinky a granulocyty. Následují procesy jako promytí, odstředění, spočítání mononukleárních buněk a vzorek je odeslán do flowcytometrické laboratoře ke stanovení infiltrace plazmatických buněk, tedy stanovení procenta plazmatických buněk CD38+138+. Poté je provedena separace PB.

Separační techniky jsou založeny na použití monoklonálních protilátek, které jsou v případě magnetické separace (MACS) konjugovány s paramagnetickou partikulí a v případě fluorescenčního sortování buněk (FACS) je monoklonální protilátka konjugována s fluorochromem.

Pro separaci MACS jsou mononukleární buňky inkubovány s protilátkami CD 138 MACS MicroBeads, které jsou namířeny proti povrchovému antigenu CD138 PB, známému jako syndecan-1. Pro magnetickou separaci slouží přístroj autoMACSpro (Miltenyi Biotec). Pro sortování FACS jsou mononukleární buňky inkubovány s 5ti fluorescenčně značenými protilátkami proti znaku CD 138, CD 19, CD 56, CD 38 a CD 45. Pro fluorescenční sortování se používá přístroj FACS Aria (BD Biosciences)

Princip magnetické separace spočívá v tom, že buňky po inkubaci procházejí kolonou umístěnou v silném magnetickém poli, magneticky označené buňky jsou zadrženy v koloně, po vyjmutí kolony z magnetického pole jsou zadržené buňky vymyty.

Při fluorescenčním sortování je buňce vybrané podle jejích fenotypových znaků udělen elektrický náboj, který ji při následném průchodu elektrickým polem (mezi dvěmi deskovými elektrodami) vychýlí z původního směru do sběrné zkumavky.

Na dalším snímku je uveden náš optimalizovaný separační algoritmus postupů po vstupním zpracování vzorků, kdy vzorky s infiltrací do 5 % jsou dále zpracovávány metodou FACS, vzorky s nebo nad 5% infiltrací metodou MACS.

Buresova I et al. Bone marrow plasma cell separation – validation of separation algorithm. Clin Chem Lab Med 2012;50(6)

Existuje několik možností separací, náš výzkumný tým se trvale snaží tuto problematiku řešit, bylo napsáno několik publikací a zveřejněn souhrnný přehled zásad separačních metod a popsán náš optimalizovaný algoritmus postupů, následujících po vstupním zpracování vzorků. Na snímku uveden přehled nejdůležitějších z nich.

Hlavním požadavkem všech výzkumných analýz je vysoká buněčnost nádorové frakce a její vysoká čistota, tedy % plazmatických buněk v pozitivní frakci.

Existují ale i mezní případy, kdy se nedá jednoznačně řídit pouze infiltrací kostní dřeně plazmatickými buňkami. U vzorků s velmi nízkou infiltrací a zároveň velmi nízkou buněčností sortujeme buňky přímo na mikroskopická skla a ta následně využíváme pro FISH analýzy. U vzorků s nízkou infiltrací, ale velmi vysokou buněčností (množství buněk nad 30 x10 ⁶ )

kombinujeme obě metody – magnetická separace na VarioMACSU výrazně, ale ne dostatečně sníží podíl negativních buněk v pozitivní frakci, která je následně dosortována metodou FACS na potřebnou čistotu. Obdobně je výhodná separace FACS pro vzorky s vysokou infiltrací, ale velmi nízkou buněčností (množství buněk do 1x10⁶)

Buresova I et al. Bone marrow plasma cell separation – validation of separation algorithm. Clin Chem Lab Med 2012;50(6)

V tabulce jsou hodnoceny čistoty pozitivní frakce separovaných buněk u vzorků zpracovávaných v roce 2012. Kdy medián čistoty u vzorků separovaných metodou MACS byl 88 %; u metody FACS 99 %. Při použití metody FACS se odlišují populace abnormálních (CD138+CD19-CD56+/-) a normálních (CD138+CD19+CD56-) plazmatických buněk u pacientů s novou diagnózou MM a dg. MGUS, ne však u pacientů s relapsem.

Při porovnání obou metod můžeme metodou FACS separovat podle několika znaků v jednom kroku, je dosaženo vysoké čistoty, ale metoda je časově náročnější.  Finanční náklady při "jednoduchém" sortování podle jednoho znaku CD138 vycházejí srovnatelně, samozřejmě náklady jsou u metody FACS vyšší při sortování na subpopulace PCs nebo při kombinaci varioMACS-FACS než u magnetické separace.

Dále je uveden výčet základních výzkumných aktivit využívající zpracovávané a archivované vzorky. K výzkumným analýzám neslouží jen pozitivní nádorové frakce buněk, ale i negativní nenádorové frakce, sérum a plazma periferní krve, plazma kostní dřeně nebo DNA izolovaná z plné periferní krve. Laboratoř průtokové cytometrie se zabývá detailním fenotypem B-lymfocytů a plazmocytů, laboratoř molekulární biologie se zabývá zejména studiem změny exprese genů na úrovni RNA a miRNA a dědičnou predispozicí v podobě SNPs analýz. Proteomické analýzy jsou založeny na hledání markerů lékové rezistence. Laboratoř molekulární cytogenetiky se zabývá rutinní analýzou cytogenetických aberací v plazmatických buňkách pacientů s MM a extramedulárním relapsem a osob s MGUS. Další cytogenetické analýzy jsou zaměřeny na hodnocení prognostického významu chromozomových aberací ve vztahu k transformaci MGUS do MM.

Čipové technologie analyzují celogenomový profil pacientů. Buď na úrovni DNA – komparativní genomová hybridizace nebo na úrovni RNA – genové expresní profilování.

Tabulka uvádí požadavky na minimální čistotu a množství nádorové frakce buněk pro vědecké analýzy pomocí moderních výzkumných metod prováděných v rámci naší skupiny. Metodiky jsou neustále optimalizovány vzhledem k nízkému počtu buněk tak, aby byly nastaveny jednotlivé analýzy na zpracování co nejnižšího počtu buněk. Např. pro metodu fluorescenční in situ hybridizace (FISH) je požadavek na minimální množství buněk 40 000 – 100 000 buněk, při výtěžku do 40 000 je proveden sort na skla (á 1000 PCs/sklo). Metoda komparativní genové hybridizace požaduje nad 150 000 buněk, metoda celogenomového expresního profilování nad 350 000 buněk. Největší požadavky na buněčnost vyžadují proteomické analýzy min. 1 mil. plazmatických buněk.

Úspěch molekulárně biologických metod je založen především na kvalitě nukleových kyselin purifikovaných z klinického materiálu. Využití dlouhodobě zamrazených vzorků pro tyto metody automaticky předpokládá dobrou molekulární stabilitu DNA. Při teplotě -80°C archivujeme genomovou DNA z plné PK, izolovanou na MagNA Pure DNA izolátoru (Roche). Koncentrace a kvalita DNA je měřena spektrofotometricky na Nanodropu ND-1000 (NanoDrop Technologies Inc, Wilmington, NC, USA). Tento materiál je vhodný zejména pro porozumění dědičných změn v oblasti nukleových kyselin (např. analýzy jednonukleotidových polymorfizmů - SNPs).

Genetická variabilita každého jedince může významně ovlivnit nejen riziko vzniku onemocnění, ale i léčebnou odpověď a toxicitu léčby. SNPs by mohly sloužit jako významné prediktivní a prognostické markery. DNA izolovaná z periferní krve slouží ke studiu genetické variability. DNA je poměrně stabilní, není náchylná během přepravy do centrální laboratoře a je vhodná pro multi-instituční studie.

Velmi vzácné varianty mohou mít hlubší dopad na riziko vzniku choroby a tudíž mají větší význam pro konkrétního jednotlivce než v rámci celé populace. Pouze prostřednictvím genotypizace velkého počtu postižených jedinců mohou být tyto vzácné varianty identifikovány. Vznik velkých konsorcií s kvalitně vedeným biobankovnictvím je příležitostí ke sledování vztahů mezi genotypem a fenotypem pacienta na větším souboru jedinců.

V posledních 10 letech začaly ve velkém měřítku vznikat systematické sbírky biologických vzorků pro farmakogenetický a farmakogenomický výzkum (McCarty, 2010).

McCarty CA, Wilke RA Biobanking and pharmacogenomics. Pharmacogenomics. 2010 May;11(5):637-41.

Identifikace interakce mezi genetickou variabilitou a environmentálními rizikovými faktory závisí na velkém objemu dat, čehož lze dosáhnout pouze prostřednictvím multicentrické spolupráce při shromažďování vzorků. U velkých studií musejí být sdílená data srovnatelná, shromážděny na základě podobných postupů kódování a kontroly dat (Riegman, 2008).

Riegman PH, Morente MM, Betsou F et al. Biobanking for better healthcare. Mol Oncol. 2008 Oct;2(3):213-22. Epub 2008 Jul 30.

Vzhledem k velkému počtu polymorfizmů v genomu jsou často zjišťovány falešně-pozitivní asociace. Pozitivní asociace musí být validovány na nezávislých kontrolních souborech, validačními analýzami dědičných genetických polymorfizmů se zabývá i náš výzkumný tým (Almáši, 2011 a Almáši, 2011).

Almasi M, Sevcikova S, Slaby O et al. Association study of selected genetic polymorphisms and occurrence of venous thromboembolism in multiple myeloma patients treated with thalidomide. Clinical  Lymphoma, Myeloma Leuk.2011 Oct;11(5):414-20.

Almáši M, Ševčíková S, Šváchová H, Sáblíková B, Májková P, Hájek R. Polymorphisms contribution to the determination of significant risk of specific toxicities in multiple myeloma. Klin Oncol 2011;24(Suppl):S39-S43.

Biologické vzorky jsou značeny specifickým kódem a archivovány kryogenním skladováním v biobance. Vzorky pozitivní frakce jsou zamraženy jako suchý pelet a uloženy v tzv. Dewarových  nádobách v atmosféře tekutého dusíku (-196 °C). Vzorky plazmy a séra jsou uloženy při teplotě -80°C. Vzorky vstupní frakce mononukleárních buněk (s nízkou buněčností a infiltrací PB) a negativní frakce jsou archivovány s použitím kryoprotektivního média DMSO (dimethyl sulfoxid). Archivace je zabezpečena monitoringem teplot, alarmem pohotovostní služby a záložním plánem v případě havárie.

Archivace vzorků v biobance je klíčovým krokem pro řadu výzkumných projektů zabývajících se patogenezí nejen MM, ale i raritních hematologických nádorových onemocnění. Pro stanovení vhodných prognostických markerů pomocí nejmodernějších výzkumných analýz je nezbytná dostupnost vysoce čisté myelomové frakce mononukleárních buněk separovaných z kostní dřeně. Rovněž archivace vzorků raritních hematologických malignit je velice důležitou součástí výzkumu.

Společné foto naší výzkumné skupiny